实验性变应性神经炎中TLR2和TLR9的表达以及TLR9拮抗剂对其发病的影响

摘要

目的：吉兰-巴雷综合征（Guillain-Barre Syndrome，GBS）是一种常见的周围神经系统自身免疫性疾病，其病理改变主要表现为周围神经的髓鞘脱失和炎性细胞浸润，其病因和发病机制尚不十分清楚。实验性变应性神经炎（experimental allergic neuritis，EAN）是研究GBS的理想动物模型，是由CD4+T细胞介导的急性多发性炎症性神经根脱髓鞘性疾病，Th1细胞与Th2细胞的功能失衡是其发病的关键。Toll样受体（Toll like receptors，TLRs）是一类新近发现的天然免疫模式识别受体，其可通过病原相关分子模式（Pathogen associated molecular patterns，PAMP）识别抗原，激活抗原呈递细胞（antigen presenting cell，APC），产生共刺激信号而促使T细胞活化。每种TLR都可识别来源于不同类型病原体的独特PAMP，其中，TLR2识别革兰氏阳性菌肽聚糖，TLR9识别DNA病毒或未非甲基化CpG DNA序列即CpG寡聚脱氧核苷酸（oligodeoxynucleotide，ODN）。已有研究发现EAN中有TLR9的表达增高，而一种抑制性ODN可以明显缓解由CpG ODN引起的RA的症状 本实验应用该抑制性ODN，即TLR9拮抗剂对EAN的发病进行干预，观察其对EAN大鼠发病的影响，并检测TLR2，TLR9在EAN大鼠的坐骨神经，脾脏，外周血，淋巴结的动态表达，旨在发现EAN中是否存在TLR2的表达异常，探讨TLR9在EAN中的具体作用，为寻找新的治疗自身免疫性疾病的策略奠定理论基础。 方法：102只Lewis大鼠，SPF级，雄性，6-8周，体重160-180g，随机分为：生理盐水组（n=6，6，6，6）；完全弗氏佐剂组（n=6，6，6，6）；EAN组（n=6，6，6，6）；ODN干预组（n=6，6，6，6）；另外在免疫动物前处死6只，以确定待测指标的基础水平。 EAN模型的建立：首先制备抗原乳剂，其流程如下：以NS溶解大鼠用周围神经髓鞘蛋白P253-78，再与完全弗氏佐剂充分混匀成乳剂（其中P2浓度为100μg/200μL）；各组处理如下：NS组大鼠以NS代替抗原乳剂注射（200μL/只）；EAN组每只老鼠注射200μL抗原乳剂，佐剂组大鼠以NS和CFA等体积混匀的乳剂200μL注射，ODN干预组大鼠免疫时，每200μL抗原乳剂加入100μg抑制性的ODN。免疫部位为：双后肢足掌皮下。 观察实验大鼠的发病情况，分别在第7天，第16天，第24天，第33天处死动物，取坐骨神经根经HE染色和weil's染色观察其病理改变，利用RT-PCR检测TLR2，TLR9的mRNA表达水平。 结果：1、在整个过程中，NS组和佐剂组大鼠无明显症状，体重一直呈上升趋势；EAN组大鼠在免疫后第11天体重开始下降，并在第17天（疾病高峰期）达最低，之后逐步增加，与NS组和佐剂组有显著差异（p<0.01）；与ODN干预组相比，p<0.05；ODN干预组大鼠临床评分明显低于EAN组，p<0.05，与NS组和佐剂组大鼠临床评分相比，差异无统计学意义，p>0.05。ODN干预组大鼠临床评分明显低于EAN组，在整个病程中体重无明显下降趋势；2、与NS组相比，EAN组大鼠TLR2在发病初即表达增高（p<0.05），高峰期上升明显（p<0.01），在恢复早期和恢复晚期表达回落，但仍高于NS组（p<0.05）；ODN干预组TLR2在发病初期和高峰期呈低表达（与NS组相比，p<0.05），在恢复期表达回升；3、与NS组相比，EAN中TLR9在发病初即有表达增高（p<0.05），在高峰期上升明显（p<0.01），在恢复期表达逐渐下降，但仍高于NS组；ODN干预组大鼠TLR9表达明显低于与EAN组，各期比较均有显著性差异（p<0.05）。 结论：1、TLR2可能参与EAN的发病；2、TLR9参与EAN疾病的诱导阶段，并在其中发挥了重要的作用；3、抑制性ODN可明显减轻EAN大鼠的临床症状。

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文摘

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论文说明：英文缩略词

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前言

第一章材料及方法

1.1动物及主要试剂

1.2主要仪器

1.3实验方法

1.3.1实验动物及分组

1.3.2 EAN模型的建立

1.3.3病理标本的制备

1.3.4 RNA的提取

1.3.5 RT-PCR

1.3.6定量

1.4数据处理

第二章结果

2.1实验大鼠体重及临床症状评分变化

2.2病理观察

2.3实验动物TLR2的表达

2.4实验动物TLR9表达

附图

第三章讨论

3.1 EAN中TLR9mRNA的表达

3.2 EAN中TLR2mRNA的表达

3.3 TLR2,TLR9与CFA的关系

3.4 TLR9拮抗剂对EAN的影响

第四章结论

参考文献

综述 TLR样受体及其在自身免疫性疾病中的研究进展

致谢