非p53、非caspase条件下Cr(Ⅵ)诱导细胞凋亡机制的初步探讨

摘要

目的：在体外试验系统，初步探讨Cr（Ⅵ）在P53缺失且caspase抑制条件下诱导Hep3B细胞的凋亡机制，进一步阐明ROS在其中的作用。 方法：以Hep3B细胞为受试细胞，通过MTT试验检测不同浓度下Z-VAD-fmk、NAC、Cr（Ⅵ）对Hep3B细胞存活率的影响，通过单细胞凝胶电泳实验观察细胞凋亡形态筛选出有效的Cr（Ⅵ）作用时间。其后续试验Cr（Ⅵ）浓度定为20μmol/L，染毒时间为6h。将Hep3B细胞随机分成对照组、Cr（Ⅵ）处理组、Z-VAD-fmk+Cr（Ⅵ）处理组、NAC+Cr（Ⅵ）处理组、Z-VAD-fmk+NAC+Cr（Ⅵ）处理组。Z-VAD-fmk和NAC分别预处理细胞1h，再加入K2Cr2O7至终浓度20μmol/L，染毒6h。姬姆萨染色、电镜观察及单细胞凝胶电泳法观察细胞凋亡形态及细胞DNA损伤情况，流式细胞仪检测细胞凋亡率，荧光分光光度法检测线粒体通透性转运孔（PTP）及跨膜电位（△ψm）、化学比色法检测细胞氧化损伤。 结果： 1.Cr（Ⅵ）引起Hep3B细胞存活率降低：Cr（Ⅵ）在2.5-100μmol/L处理浓度范围内，能明显引起Hep3B细胞存活率的降低（P<0.05），处理浓度和细胞存活率之间存在负相关（r=0.893）。 2.染毒处理导致DNA损伤：与对照组相比，Cr（Ⅵ）、Z-VAD-fmk+Cr（Ⅵ）、NAC+Cr（Ⅵ）和Z-VAD-fmk+NAC+Cr（Ⅵ）处理组能明显诱导细胞DNA链断裂，彗星数量增多（P<0.05）；NAC+Cr（Ⅵ）、Z-VAD-fmk+NAC+Cr（Ⅵ）处理组，与Cr（Ⅵ）处理组相比DNA损伤程度减轻（P<0.05）。 3.染毒处理对Hep3B细胞形态学的影响：Cr（Ⅵ）处理6h，引起Hep3B细胞皱缩或肿大，染色质浓染，细胞间隙扩大，空泡样变，细胞膜和核膜不完整或消失，染色质嗜碱性降低。电镜下观察，可发现Cr（Ⅵ）染毒组细胞出现表面微绒毛减少，线粒体肿胀、嵴消失、空泡状变，细胞核内出现透亮区、呈空泡状变等细胞凋亡或坏死的表现。加入NAC有保护作用。 4.染毒处理对Hep3B细胞凋亡的影响：与对照组相比，Cr（Ⅵ）、Z-VAD-fmk+Cr（Ⅵ）、NAC+Cr（Ⅵ）和Z-VAD-fmk+NAC+Cr（Ⅵ）处理组能明显诱导Hep3B细胞细胞发生凋亡和坏死（P<0.05）；NAC有明显保护作用（P<0.05）。 5.染毒处理导致Hep3B细胞线粒体膜损伤：与对照组相比Cr（Ⅵ）、Z-VAD-fmk+Cr（Ⅵ）、NAC+Cr（Ⅵ）和Z-VAD-fmk+NAC+Cr（Ⅵ）处理组细胞线粒体膜电位（△ψm）降低，PTP开放度增加，差异有显著性（P<0.05）。加入NAC后有明显的拮抗作用（P<0.05）。 6.染毒处理导致细胞氧化损伤：Cr（Ⅵ）、Z-VAD-fmk+Cr（Ⅵ）、NAC+Cr（Ⅵ）和Z-VAD-fmk+NAC+Cr（Ⅵ）染毒组引起SOD、CAT、GR活性明显降低，NO、MDA生成增多，与对照组比较差异有显著性（P<0.05）；加入NAC后有明显保护作用（P<0.05）。 结论：20μmol/L Cr（Ⅵ）能明显引起Hep3B细胞氧化应激，导致细胞DNA损伤、线粒体膜损伤、细胞凋亡等；同时在抑制caspase条件下，受试细胞仍然发生凋亡。结果提示，Cr（Ⅵ）诱导的凋亡可能存在非p53、非caspase途径，其中ROS起重要作用。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章前言

第二章材料与方法

2.1材料

2.1.1受试细胞

2.1.2主要试剂

2.1.3试验溶液配制

2.1.4主要仪器

2.2方法

2.2.1试验技术路线

2.2.2细胞培养

2.2.3细胞生存率测定(MTT法)

2.2.4细胞DNA损伤的检测(单细胞凝胶电泳)

2.2.5细胞形态学观察

2.2.6细胞凋亡率检测(流式细胞仪分析法)

2.2.7线粒体膜损伤

2.2.8细胞氧化损伤指标的测定(化学比色法)

2.2.9统计分析

第三章结果

3.1 Cr(Ⅵ)对Hep3B细胞生存率的影响

3.2 Cr(Ⅵ)诱导Hep3B细胞DNA损伤

3.3 Cr(Ⅵ)诱导Hep3B细胞形态学改变

3.3.1普通光学显微镜观察(姬母萨染色法)

3.3.2电镜观察

3.4 Cr(Ⅵ)诱导Hep3B细胞凋亡

3.5 Cr(Ⅵ)诱导线粒体损伤

3.5.1 Cr(Ⅵ)对Hep3B细胞线粒体PTP开放度的影响

3.5.2 Cr(Ⅵ)对Hep3B细胞线粒体跨膜电位(△ψm)的影响

3.6 Cr(Ⅵ)诱导Hep3B细胞氧化损伤

第四章讨论

4.1非p53非caspase条件下Cr(Ⅵ)诱导细胞线粒体损伤、DNA损伤与氧化应激的关系

4.2非p53非caspase条件下Cr(Ⅵ)细胞凋亡的可能机制

4.3非p53非caspase条件下NAC拮抗Cr(Ⅵ)诱导细胞凋亡的可能机制

第五章结论

参考文献

综述：铬化合物氧化损伤的研究进展

致谢

附录1 英文缩略表

研究生期间成绩