O标记定量蛋白质组学结合LCM技术筛查胃癌标志物

摘要

胃癌是目前世界上发病率第四位的肿瘤，居消化道恶性肿瘤发病率及病死率的第一位。其发病有着明显的地域分布特点，2/3的病例分布在发展中国家，尤以日本、中国及其它东亚国家高发。虽然研究结果认为胃癌的发病与幽门螺杆菌（helicobacter pylori，Hp）感染、遗传因素和环境因素密切相关，但胃癌的发病机制目前仍然不清楚。由于缺乏胃癌早期诊断、监测疾病过程的特异肿瘤标志物，大多数胃癌患者确诊时已经处于中晚期。早期胃癌根治术5年生存率可达90％～95％，而中晚期胃癌后5年生存率明显降低，仅为20％～30％。因此发现新的胃癌分子标志物将有助于胃癌的诊断、治疗和发病机制研究。 近年来，蛋白质组学技术已经成为研究临床肿瘤疾病普查和早期诊断蛋白质标记物的有效工具，同时为研究肿瘤发生和发展的机制提供了技术平台。常用的蛋白质组分析技术（双向聚丙烯酰胺凝胶电泳，two dimensional gel electrophoresis，2DE）存在敏感性、特异性、重复性较差，对疏水蛋白、小分子蛋白、膜蛋白分离有限等缺陷。因此采用高通量、更加精确的定量蛋白质组方法显得非常必要。基于稳定同位素标记与质谱联用的定量蛋白质组学是目前蛋白质组学研究技术中发展较快的领域，其中18O稳定同位素标记技术因其技术相对简单，处理步骤少，试剂便宜等优点，在定量蛋白质组学研究中受到越来越多的关注。 肿瘤组织与其起源的正常组织比较蛋白质组学研究是发现肿瘤标志物和治疗靶标的最直接和合理的方式之一。然而，采用组织样本进行蛋白质组学研究的主要障碍是组织的异质性。因此，为提高比较蛋白质组学研究筛选肿瘤分子标志物的准确性，有必要纯化靶细胞用于蛋白质组学研究。最近发展起来的激光捕获显微切割（LCM）技术，以其简单、快速、精确度高等多功能特点，成功地解决了从所需标本不同成分中获取纯净细胞这一问题，广泛用于肿瘤学、细胞发生学和其他学科的研究，为肿瘤蛋白质组学研究提供了最佳的生物样本。 为了分离鉴定胃癌相关蛋白，筛查胃癌分子靶标，本研究采用LCM技术分别从手术胃腺癌组织和良性胃黏膜上皮组织（non-malignant gastric epithelial tissue，NMGET）样本中纯化相应的胃腺癌细胞（gastric adenocarcinoma cell，GAC）及其正常胃黏膜上皮细胞（Normal gastric epithelial cell，NGEC）。18O稳定同位素标记定量蛋白质组学方法分离鉴定两种细胞间的差异蛋白质。验证并探讨差异蛋白质的临床病理意义。 第一章18O标记定量蛋白质组学结合LCM技术筛选胃腺癌差异表达蛋白质 目的：准确筛查GAC和NGEC差异表达蛋白质。方法：LCM技术纯化GAC和NGEC；应用1D-SDS-PAGE技术预分离两种样本总蛋白；优化稳定高效的18O/16O标记技术，并用18O/16O分别标记GAC和NGEC多肽混合物，纳升级反相液相色谱串联质谱（Nano-RPLC-MS/MS）分离鉴定差异蛋白质。结果：建立了稳定高效的18O标记技术；总共分离鉴定出306个蛋白质，78个蛋白质差异表达在2倍以上，其中42个蛋白在GAC中高表达，36个蛋白较NGEC中表达降低。结论：18O标记定量蛋白质组学结合LCM技术能够准确定量并鉴定胃腺癌差异蛋白质。该技术为实体瘤分子靶标的筛查提供了新的技术平台。 第二章胃癌差异蛋白质表达验证及临床病理意义研究 目的：验证胃癌差异蛋白质并探讨其临床病理意义。方法：Western blotting检测了5个差异表达蛋白质（Moesin、Periostin、AnnexinA2、AnnexinA4和RKIP）在GAC和NGEC中的表达水平；免疫组化（IHC）检测RKIP、S100A9、AnnexinA2和AnnexinA4等蛋白在70例良性胃黏膜组织、118例胃癌组织和35例转移的淋巴结组织中的表达。结果：（1）Western blotting结果显示，Moesin、Periostin、AnnexinA2、AnnexinA4在GAC中高表达，RKIP在GAC中低表达。（2）免疫组化（IHC）结果显示，RKIP蛋白在良性胃黏膜组织中、胃癌组织和转移的淋巴结组织中阳性表达率分别为97.14％（68/70）、45.76％（54/118）、0（0/35）。RKIP蛋白表达与胃癌的浸润深度、TNM分期及淋巴结转移成负相关，与分化程度成正相关（P<0.01）。（3）S100A9在良性胃黏膜组织、胃癌组织和转移的淋巴结组织中阳性表达率分别为高表达32.86％（23/70）、61.02％（72/118）、82.86％（29/35）；S100A9蛋白表达与胃癌的TNM分期及淋巴结转移成正相关，与分化程度成正相关（P<0.05）；且在弥漫性胃癌中较肠型胃癌中表达更显著（P<0.05）。（4）AnnexinA2在良性胃黏膜组织和胃癌组织阳性表达率分别为42.86％（30/70）、59.32％（70/118）；其表达与胃癌的浸润深度、TNM分期及淋巴结转移成正相关（P<0.05）.（5）AnnexinA4在良性胃黏膜组织和胃癌组织阳性表达率分别为38.57％（27/70）、55.93％（66/118）。其表达与胃癌的浸润深度、TNM分期及淋巴结转移成正相关（P<0.05）。结论：Western blotting和IHC验证差异蛋白表达水平与18O标记定量蛋白质组结果一致，18O标记定量蛋白质组技术定量结果准确可靠。RKIP、S100A9、AnnexinA2和AnnexinA4蛋白与胃癌的恶性生物学行为相关，有望成为潜在的诊断胃癌、预测胃癌转移、鉴别胃癌分化程度、浸润深度及TNM分期的分子标志物。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写词简表

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前言

技术路线

第一章 18O标记定量蛋白质组学结合LCM技术筛选胃腺癌差异蛋白质

1.1引言

1.2材料与方法

1.3结果

1.4讨论

1.5结论

第二章 胃癌差异蛋白质表达验证及临床病理意义研究

2.1引言

2.2材料和方法

2.3结果

2.4讨论

2.5结论

全文总结

参考文献

蛋白质组学技术及有胃癌中的研究过展

致谢

攻读学位期间主要的研究成果