Fas-siRNA对Fas/FasL依赖的LPS诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡和炎症反应的影响

摘要

目的: 通过建立LPS诱导体外培养大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤模型，探讨1、Fas-siRNA转染肺泡Ⅱ型上皮细胞的可行性；2、Fas-siRNA对Fas/FasL依赖的LPS诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡和炎症反应的影响。 方法: 经分离纯化大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞，随机分为5组：空白组：AECⅡ（仅加脂质体）、AECⅡ+siRNA-213组、AECⅡ+siRNA-641组、AECⅡ+siRNA-830组、AECⅡ+阴性对照siRNA组。6h后观察转染效率，48h后RT-PCR检测Fas mRNA表达。肺泡Ⅱ型上皮细胞分为5组：对照组、LPS组、LPS+FasL组、FasL组、LPS+FasSiRNA+ FasL组，转染FasSiRNA后20小时，加入LPS和FasL，加入PBS为每孔容积1ml，终浓度分别为10ug/ml和5ng/ml，继续培养48小时，RT-PCR、Westen Blot检测Fas的表达，Westen Blot检测p-caspase8，流式检测细胞凋亡，ELISA检测培养液上清MCP-1和TNF-α的浓度。 结果: 1、siRNA转染效率超过80％，与空白组与阴性对照组比较，AECⅡ+siRNA-213组、 AECⅡ+siRNA-641组、AECⅡ+siRNA-830组Fas-mRNA表达抑制（p<0.05），AECⅡ+siRNA-641组Fas-mRNA表达最低（p<0.05）；2、与control组比较，LPS组、LPS+ FasL组FasmRNA、Fas蛋白表达增加（p<0.05），FasL组、LPS+FasSiRNA+FasL组Fas mRNA、Fas蛋白表达未见明显差异（p<0.05）；与LPS组比较，LPS+FasSiRNA+ FasL组Fas mRNA、Fas蛋白表达明显下调（p<0.05）；与control组比较，LPS组、FasL组、LPS+ FasL组、LPS+FasSiRNA+ FasL组肺泡Ⅱ型上皮细胞p-caspase表达、细胞凋亡和细胞培养液上清TNF-α和MCP-1浓度明显增加（p<0.05）；与LPS组比较，LPS+ FasL组肺泡Ⅱ型上皮细胞p-caspase表达、细胞凋亡和细胞培养液上清TNF-α和MCP-1浓度明显增加（p<0.05）；与LPS+ FasL组比较，LPS+FasSiRNA+FasL组p-caspase表达和细胞凋亡减少，TNF-α和MCP-1浓度明显下降（p<0.05）。 结论: Fas-siRNA成功转染原代培养的肺泡Ⅱ型上皮细胞；Fas基因沉默可减轻Fas/FasL系统依赖的LPS诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡和炎症反应。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 前言

第二章材料与方法

2.1材料

2.2方法

2.2.1大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AEC Ⅱ)原代培养及鉴定

2.2.2确认RNAi干预的有效目的片断，Fas-siRNA转染肺泡Ⅱ型上皮细胞的可行性

2.2.3 Fas基因沉默对Fas／FasL系统依赖的LPS诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡和炎症反应的影响

2.2.4统计学处理

第三章结果

3.1细胞形态学及原代培养观察

3.2 Fas-siRN实验

3.3不同处理后细胞Fas mRNA、Fas蛋白和p-caspase8的表达水平

3.4不同处理后肺泡Ⅱ上皮细胞凋亡

3.5不同处理后肺泡Ⅱ型上皮细胞TNF-α和MCP-1的分泌

第四章讨论

4.1大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞体外培养

4.2 Fas-siRNA体外转染肺泡Ⅱ型上皮细胞

4.3 Fas／FasL系统激活对LPS诱导的肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡和炎症反应的影响

4.4 Fas基因沉默减轻Fas／FasL系统依赖的LPS诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡和炎症反应

4.5 Fas基因沉默减轻Fas／FasL系统依赖的LPS诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡和炎症反应的临床意义

第五章结论

参考文献

综述 急性肺损伤中Fas／FasL系统与肺泡Ⅱ型上皮细胞

致谢

攻读学位期间发表论文