Fas/FasL途径在海水诱导肺泡上皮细胞凋亡中的调控作用

摘要

研究背景
　　淹溺是人类意外死亡的重要原因，是全球性的公共卫生课题之一。在海上工农业生产、军事行动和日常生活中，海水淹溺事件时有发生。海水进入呼吸道可直接导致溺水者窒息死亡，海水充塞肺泡后引起海水淹溺性肺水肿（pulmonaryedemaofseawaterdrowning，PE-SWD），导致海水淹溺型急性肺损伤（seawaterdrowning-inducedacutelunginjury，SW-ALI），继而恶化为海水淹溺型呼吸窘迫综合征（seawaterdrowning-inducedrespiratorydistresssyndrome，SW-RDS）。
　　SW-ALI发生时，进入肺内的海水直接损伤肺泡上皮细胞（alveolarepithelialcell，AEC），并由此导致低氧血症和酸中毒。因此，AEC对SW-ALI的发生、发展及预后至关重要。同时既往研究表明，Fas/FasL途径是急性肺损伤（acutelunginjury，ALI）时AEC凋亡的重要机制之一。我们前期实验已证实，SW-ALI存在肺组织细胞凋亡。但海水是否通过Fas/FasL途径诱导AEC凋亡尚不清楚。
　　目的
　　通过建立SW-ALI动物模型和使用海水干预人肺泡上皮A549细胞，观察海水对AEC凋亡的影响，阐明Fas/FasL途径在海水诱导AEC凋亡中的作用。
　　方法
　　1、动物实验：48只SD雄性大鼠随机分为四组：（1）正常对照组；（2）1h海水组；（3）2h海水组；（4）4h海水组。麻醉后，除正常对照组外，其余各组大鼠通过气管在4min内匀速滴入4ml/kg海水。于各时间点将动物处死后取肺组织，分别检测肺湿/干比（W/D）、肺泡灌洗液（BALF）蛋白浓度、伊文斯蓝漏出指数（ELI）；行肺组织病理染色（HE）和海水灌注4h后Fas和FasL蛋白免疫组化染色；Westernblotting检测Fas、FasL、cleavedcaspase-8、cleavedcaspase-3蛋白。
　　2、细胞实验：10％、20％、40％和60％海水（海水与培养基体积比分别为1:9、1:4、2:3和3:2）刺激人肺泡上皮A549细胞6h；40％海水刺激A549细胞1h、2h、4h和6h，观察相同时间不同浓度海水和同一浓度海水不同时间对细胞凋亡的诱导作用。为明确FasL和caspase-8蛋白激活与海水诱导A549凋亡之间的关系，选择40％海水干预6h作进一步研究，在加入海水前60min，10μg/ml抗FasL中和性抗体NOK-2或20μΜcaspase-8抑制剂Z-IETD-FMK预孵育细胞，流式细胞仪检测凋亡，Westernblotting检测各组Fas、FasL、cleavedcaspase-8、cleavedcaspase-3蛋白表达。
　　结果
　　1、动物实验：海水吸入后，大鼠肺W/D、BALF蛋白浓度及ELI明显升高，结合HE结果表明海水导致了典型的ALI。免疫组化和Westernblotting检测结果显示，海水同时上调Fas、FasL蛋白的表达，cleavedcaspase-8、cleavedcaspase-3蛋白也相应增加。
　　2、细胞实验：海水呈浓度和时间依赖性诱导A549细胞凋亡，同时Fas、FasL、cleavedcaspase-8和cleavedcaspase-3蛋白表达相应上调。加入NOK-2或Z-IETD-FMK可明显减少细胞凋亡，而且NOK-2能够降低FasL的表达和caspase-8、caspase-3蛋白活化，但对Fas没有影响；Z-IETD-FMK不能抑制Fas、FasL的表达，但可减弱caspase-8、caspase-3的激活。
　　结论
　　海水可导致AEC凋亡，Fas/FasL介导的死亡受体信号途径是SW-ALI时AEC凋亡调控的重要分子机制。这为临床从凋亡角度入手，探索干预和治疗SW-ALI的新方法提供了实验依据。

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缩略语表

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前言

文献回顾

一、淹溺与海水淹溺

二、凋亡

三、ALI 与 AEC 凋亡

正文

实验一 Fas/FasL 途径在大鼠海水淹溺型肺损伤肺组织细胞凋亡中的调控作用

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 Fas/FasL 途径在海水诱导人肺泡上皮A549 细胞凋亡中的调控作用

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢