耐环丙沙星鲍曼不动杆菌主动外排机制的研究及耐药逆转初步探讨

摘要

目的：了解长沙地区鲍曼不动杆菌对环丙沙星的耐药现状，为临床治疗鲍曼不动杆菌感染、合理应用喹诺酮类抗生素提供指导；研究鲍曼不动杆菌对喹诺酮类药物的耐药性与主动外排机制的关系；初步探讨鲍曼不动杆菌对喹诺酮类药物的耐药逆转机制，寻求恢复其对喹诺酮类药物敏感性的方法。 方法：⑴微量稀释法检测56株鲍曼不动杆菌对环丙沙星的敏感性。⑵采用直接荧光法筛选出胞内环丙沙星聚集量明显差异的菌株作为耐药组，并测定敏感组和耐药组在有无外排泵抑制剂情况下，鲍曼不动杆菌对环丙沙星的吸收和积累情况。⑶用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测主动外排泵基因adeABC的表达水平。⑷扩增adeABC自身启动子区域片段基因并测序。⑸逆转实验观察三种抑制剂对外排泵的抑制作用。 结果：①56株鲍曼不动杆菌中，对环丙沙星耐药的有48株（MIC>4 mg/l）；对环丙沙星中介有0株（1 mg/l≤MIC≤4mg/l）；对环丙沙星敏感的有8株（MIC<1 mg/l）。②耐环丙沙星的所有菌株中，挑选胞内环丙沙星药物浓度累积差异最大的6株作为耐药组（R组），与敏感组（S组）相比较：无NaN3时，S组的累积量（138.01±0.251 ng/ml）明显高于R组（62.15±0.743 ng/ml）（P<0.01）；加入NaN3后，R组的累积量明显上升（114.78±0.415 ng/ml），与无NaN3的S组（138.01±0.251 ng/ml.）无差异（P>0.05），但是与无NaN3的R组（62.15±0.743 ng/ml）有明显差异（P<0.05）；加NaN3后的S组（138.27±0.177 ng/ml）与未加NaN3时（138.01±0.251 ng/ml）无明显差异（P>0.05）。③耐药组主动外排基因adeB的表达水平（2.372±0.032）明显高于敏感组（1.654±0.040）（P<0.01）。④adeABC自身启动子区域没有发现有意义突变。⑤分别在环丙沙星中加入外排泵抑制剂NaN3、MC-207110或利血平后，临床分离敏感株MIC值变化不大；临床分离耐药株MIC均有所下降，且MIC值下降至原值1/4的株数（即外排阳性株）分别为6株、6株和2株。 结论：⑴长沙地区鲍曼不动杆菌对环丙沙星的耐药率高达85.7％。⑵adeABC基因的过度表达是鲍曼不动杆菌对环丙沙星耐药的重要原因之一。⑶在对环丙沙星耐药的鲍曼不动杆菌中，adeB自身启动子区域未见有意义突变。⑷使用外排泵抑制剂MC-207110和NaN3后耐药株对环丙沙星的敏感性有显著的恢复；利血平对外排泵adeABC的抑制作用不如前两者明显。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略表

声明

前言

第一章 材料与方法

1材料

1.1菌株来源

1.2主要试剂以及来源

1.3主要仪器

1.4主要培养基和试剂的配制

2方法

2.1实验技术路线

2.2临床菌株的保存

2.3微量稀释法药敏实验（96孔微量板法）

2.4 CIP累积量差异测定

2.5主动外排泵基因adeABC的表达水平测定

2.6 adeABC自身启动子区域扩增与测序

2.7外排泵抑制试验

第二章 结果

1 56株鲍曼不动杆菌对环丙沙星的敏感性

2直接荧光法测定鲍曼不动杆菌对环丙沙星胞的累积量

2.1环丙沙星标准曲线的制作

2.2组间对照结果

3 adeB基因mRNA表达水平测定结果

3.1 RNA抽提结果

3.2靶基因片段扩增结果

3.3 adeB基因的相对表达水平分析

4 adeB基因自身启动子区的扩增、测序以及分析

4.1adeB自身启动子相关基因片段PCR扩增结果

4.2测序结果

4.3结果比对分析

5逆转试验结果及分析

第三章 讨论

第四章结论

第五章 进一步实验

参考文献

综述：耐喹诺酮类鲍曼不动杆菌外排泵机制及外排抑制剂的研究进展

致谢