内质网庆激介导COPD肺泡上皮细胞凋亡及GRP78抗凋亡作用

摘要

研究背景：肺泡上皮细胞凋亡是COPD发病的重要机制之一。内质网应激(ERS)介导的细胞凋亡途径是一条新的细胞凋亡途径。有关ERS标志性分子GRP78的生物学功能的研究已经引起生物学家们的广泛重视,GRP78在ERS时表达增加,被认为可以减轻ERS,从而减少细胞凋亡。GRP78表达上调的信号传导通路目前不完全清楚,有研究提示p38MAPK途径可以上调GRP78的表达。吸烟是COPD最重要的发病因素。香烟烟雾中富含氧自由基和多种毒性成分,氧化应激和毒性物质都是ERS的诱发因素,因此吸烟很可能触发ERS。国内外研究均证实,在COPD中,香烟烟雾可以引起p38MAPK的活化。结合上述研究,我们推测在COPD发生过程中,吸烟可能通过诱导ERS导致肺泡上皮细胞凋亡从而参与COPD肺气肿的形成,在此过程中GRP78表达上调,发挥抗凋亡作用,p38MAPK途径在香烟烟雾诱导肺泡上皮细胞GRP78表达过程中起重要的调控作用。本研究拟以COPD大鼠及香烟烟雾提取物(CSE)干预的A549细胞为主要模型,探讨香烟烟雾诱导ERS的发生、GRP78的抗凋亡作用以及p38MAPK途径在GRP78表达过程中的调控作用。
　　 第一章 COPD大鼠肺组织内质网应激与细胞凋亡
　　 目的：观察COPD大鼠肺组织内质网应激的发生及肺泡上皮细胞的调亡情况。
　　 方法：24只Wistar大鼠随机均分为2组:正常对照组和COPD模型组。采用被动吸烟加气管内注射脂多糖法建立COPD大鼠模型。造模完成后,测定各组大鼠的肺功能、观察肺组织病理学变化、免疫组化检测GRP78在肺组织中的表达和分布,RT-PCR检测GRP78、CHOPmRNA水平,Western blot检测GRP78、CHOP、active caspase-12蛋白水平。TUNEL法检测肺泡上皮细胞凋亡。
　　 结果： COPD模型组大鼠FEV0.3/FVC(％)、动态肺顺应性(Cdyn)均较对照组明显降低,而气道阻力(RI)明显增高;免疫组化结果显示GRP78表达于肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞、血管内皮细胞等细胞的细胞浆中,以肺泡上皮细胞明显。对照组GRP78呈弱阳性表达,阳性产物为棕黄色颗粒;模型组GRP78呈强阳性表达,阳性产物为棕褐色颗粒。与对照组相比,模型组肺组织GRP78表达显著增高;RT-PCR结果显示COPD模型组大鼠支气管肺组织中GRP78 mRNA和CHOPmRNA表达量较对照组显著增高;Western blot结果显示COPD模型组大鼠肺组织中GRP78、CHOP、active caspase—12蛋白表达较正常对照组显著增高;TUNEL法结果显示COPD模型组肺泡上皮细胞凋亡指数较正常对照组显著增高。
　　 结论：采用被动吸烟加气管内注射脂多糖的方法,成功复制出了COPD大鼠模型;COPD大鼠肺组织发生了内质网应激,尤以肺泡上皮细胞明显;COPD大鼠肺泡上皮细胞凋亡增加,内质网应激可能是介导肺泡上皮细胞发生凋亡的重要途径。
　　 第二章香烟烟雾提取物诱导肺泡上皮细胞GRP78的表达及其抗凋亡作用
　　 目的：观察CSE对A549细胞GRP78表达的影响,并探讨GRP78抗细胞凋亡作用。
　　 方法：第一部分,体外培养A549细胞,给予不同浓度(0％-10％)和不同时间(0h-24h)的CSE干预后,以RT-PCR、Western blot分别检测GRP78 mRNA和蛋白表达;第二部分,将A549细胞分为四个处理组:对照组,5％CSE组,GRP78siRNA+5％CSE组,controlsiRNA+5％CSE组。以RT—PCR、Western blot分别检测GRP78 mRNA和蛋白的表达水平,Western blot检测active caspase-3蛋白表达水平,TUNEL检测A549细胞凋亡指数(AI)的变化。
　　 结果：随着CSE浓度的增加或干预时间的延长,A549细胞GRP78 mRNA及GRP78蛋白表达量逐渐增加,以5％CSE、干预12h组增加最明显,但继续增加CSE浓度或延长干预时间,GRP78表达并不增加,反而下降;小干扰GRP78后,RT-PCR、Western blot检测小干扰组GRP78表达显著下降,GRP78siRNA成功下调了GRP78基因表达; GRP78水平下调后,A549细胞active caspase-3的蛋白表达水平和细胞凋亡指数与单纯的CSE刺激组比较显著升高。
　　 结论：低浓度、短时间CSE刺激后,A549细胞启动了保护性的非折叠蛋白反应,GRP78表达上调。但高浓度、长时间CSE刺激,内质网出现功能障碍,其保护机制失代偿,GRP78表达反而下降;GRP78抵抗香烟烟雾提取物诱导的A549细胞凋亡。
　　 第三章 p38MAPK在香烟烟雾提取物诱导肺泡上皮细胞GRP78表达过程中的调控
　　 目的：明确p38MAPK在CSE诱导肺泡上皮细胞GRP78表达过程中的调控作用。
　　 方法：第一部分,24只Wistar大鼠随机均分为2组:正常对照组和COPD模型组。采用被动吸烟加气管内注射脂多糖法建立大鼠COPD模型。造模完成后,Western blot检测各组大鼠肺组织内P-p38、GRP78蛋白表达水平,并将二者进行相关性分析;第二部分,将A549细胞分为三个处理组:对照组,5％CSE组,SB203580+5％CSE组,以RT-PCR、Western blot分别检测GRP78 mRNA和蛋白的表达水平变化。
　　 结果： COPD模型组大鼠支气管肺组织中P-p38蛋白表达水平较对照组显著升高,且P-p38蛋白水平与GRP78蛋白表达呈正相关(r=0.848,P＜0.01);p38MAPK抑制剂SB203580干预后,P-p38蛋白表达水平显著降低。抑制Tp38MAPK通路活化后再给予CSE干预,GRP78 mRNA及GRP78蛋白表达水平较单纯的CSE刺激组显著降低。
　　 结论： COPD中p38MAPK途径发生了磷酸化激活;p38MAPK途径能上调香烟烟雾提取物诱导的GRP78表达水平。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:缩略词

前言

第一章 COPD大鼠肺组织内质网应激与细胞凋亡

1.1 前言

1.2 材料与方法

1.3 结果

1.4 讨论

1.5 结论

第二章 香烟烟雾诱导肺泡上皮细胞GRP78的表达及抗凋亡作用

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.3 结果

2.4 讨论

2.5 结论

第三章 p38MAPK在香烟烟雾诱导肺泡上皮细胞GRP78表达过程中的调控

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.3 结果

3.4 讨论

3.5 结论

参考文献

综述 内质网应激与细胞凋亡

攻读学位期间主要研究成果

致谢