miR-199a调控黑色素瘤细胞转移相关基因的筛选

摘要

目的:构建miR-199a过表达和表达抑制的黑色素瘤高转移细胞B16F10,运用基因芯片技术筛选黑色素瘤转移相关基因,为黑色素瘤细胞侵袭、转移机制的研究和寻找有效的治疗方法提供理论基础。
　　 方法:构建靶向miR-199a的过表达质粒及inhibitor干扰单链,运用基因转染技术将其转入黑色素瘤高转移细胞B16F10中,使miR-199a过表达或表达抑制,并验证其表达。抽提细胞RNA,紫外分光光度计检测RNA提取物浓度及纯度、变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA提取物完整性。采用包含84个已知肿瘤转移基因的基因芯片(基因芯片实验由上海康成生物工程公司进行,采用美国SABiosciences公司提供的肿瘤转移PCR芯片),以Real-time PCR筛选miR-199a调控黑色素瘤中表达上调或下调2倍以上的基因。在差异表达的基因中选取2～3个基因,用RT-PCR验证其表达。
　　 结果:1.RNA溶液的A260/A280的比值可反映RNA的纯度,理想的比值范围为1.8到2.1,本实验数据中各组A260/A280值均大于1.8,接近2.0,RNA纯度较理想。电泳图谱中可见18s rRNA、28s rRNA、5s rRNA的三条带,28S条带的密度大约是18S条带的2倍,说明RNA提取物未分解、较完整。
　　 2.Real-time PCR基因芯片分析RNA样本:干扰组与过表达组相比,上调2倍以上的基因是:Cd44、Cdh1、Cxcr4、Etv4、Fxyd5、Rpsa、Mmp3、Mya、Rb1、Tcf20、Hprt1、Actb1等12个基因,下调2倍以上的基因是:Ctsk、Itga7、Tnfsf10等3个基因;干扰组与空白组相比,上调2倍以上的基因是:Cxcr4、Ctbp1、Rpsa、Mycl1、Mmp3、Mmp13、Kiss1r、Hgf、Htatip2、II18、II8rb、Cd82、Kiss1、Timp4等14个基因,无差异性表达下调的基因;过表达组与空白组相比,上调2倍以上的基因是:Cxcr4、Ctsk、Csf1、Ela2、Mmp3、Mmp13、P2ry5、Kiss1r、Hgf、Hras1、Htatip2、II18、II8rb、Kiss1、Timp4、Itga7、Tnfsf10等17个基因,下调2倍以上的基因是:Cdh1、Etv4、Fxyd5、Myc、Nme2、Rb1、Hprt1等7个基因。
　　 3.RT-PCR验证相关基因的表达:在差异性表达的候选肿瘤转移基因中,选择差异性表达2倍以上的Myc基因和Tnfsf10基因进行RT-PCR实验,从电泳图结果可见在353bp和257bp处可见较为清晰的电泳条带,分别为Myc基因和Tnfsf10基因,电泳图片符合基因芯片筛选结果。
　　 结论:在miR-199a调控的黑色素瘤转移相关基因中,可能正向调控黑色素瘤B16F10细胞生长、侵袭的基因有:Cd44、Cdh1、Ctbp1、Etv4、Fxyd5,Rpsa、Mycl1、Myc、Nme2,Cd82、Rb1,Tcf20、Hprt1、Actb1;可能负向调控黑色素瘤B16F10细胞生长、侵袭的基因有:Ctsk、Csf1、Ela2、P2ry5、Hras1、Ctsk、Itga7、Tnfsf10。经RT-PCR验证,Myc基因受miR-199a负调控,Tnfsf10基因受miR-199a正调控。