基于气质联用的代谢组学研究及其在儿童肥胖与2型糖尿病中的应用

摘要

代谢组学作为继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后的又一系统性地研究生命体系的策略，已广泛应用于疾病诊断及作用机理、药物毒理学、药效评价、基因功能及中药质量控制等领域。在代谢组学研究中存在着两个重大的挑战：一是对代谢物组的定性定量分析，二是对代谢组学数据的挖掘和解释，如寻找相关生物标记物以及如何将代谢组学的结果与临床实践联系起来等。本论文将针对这两个问题展开研究，一是建立基于GC/MS联用技术的代谢物组的定性定量分析方法，二是发展基于化学计量学多元思想的代谢组学方法，并将其应用于以下几个方面的研究：儿童肥胖的潜在生物标记物的筛选及其代谢组学结果与临床参数的关系；空腹血糖受损(impaired fasting glucose,IFG)以及2型糖尿病的潜在生物标记物的筛选；2型糖尿病强化治疗的药效评价及治疗相关潜在生物标记物的筛选；儿童肥胖与2型糖尿病之间的联系。主要内容包括：
　　 一、采用硅烷化衍生健康人血浆样本，GC/MS检测，并辅助以自动解卷积软件和化学计量学多元分辨技术，建立了血浆代谢组学定性定量分析技术平台。该方法能同时检测出血浆中的糖、氨基酸、脂肪酸、有机酸等重要的内源性代谢产物。色谱峰采用自动质谱解卷积和识别系统(Automated mass spectral deconvolution and identificationsystem,AMDIS)以及化学计量学多元分辨技术如直观推导式演进特征投影法(heuristic evolving latent projections,HELP)等进行定性定量分析。所建立的方法为尿样、脑脊液等其它生物体液和组织的代谢组学定性定量分析平台的建立提供了基础。（第二章）
　　 二、将代谢组学方法应用于儿童肥胖相关代谢紊乱的发现、潜在生物标记物的筛选以及代谢组学结果与临床参数关系的研究。运用所建立的定性定量分析平台对正常体重儿童、超重儿童以及肥胖儿童的血浆样本进行代谢组学分析。采用非相关线性判别分析(uncorrelated linear discriminant analysis, ULDA)发现三类样本的代谢模式具有显著差异，表明儿童肥胖中存在着代谢紊乱。典型相关分析(canonical correlation analysis,CCA)结果表明代谢组学结果和临床指标之间具有良好的线性关系，并且临床参数中的腰臀比(waist-hip ratio,WHR)比用来筛查儿童肥胖的体重指数(body-mass index,BMI)在这个线性关系中具有更重要的作用。另外，ULDA和CCA的结果均表明异亮氨酸、丝氨酸、2，3，4-三羟基丁酸和苯丙氨酸为儿童肥胖的潜在生物标记物。该方法为将代谢组学的结果应用于临床打下了基础。（第三章）
　　 三、糖尿病前期相关生物标记物的筛选对糖尿病的预防具有重要作用。采用基于GC/MS的代谢组学方法得到了健康对照以及IFG患者的血浆代谢谱。主成分分析(principal component analysis,PCA)表明两类样本有离散趋势。偏最小二乘-判别分析(partial leastsquares-discriminant analysis，PLS-DA)结合单变量t-检验的结果表明，乳酸、2-酮基异己酸、丙氨酸、α-羟基丁酸、尿素、磷酸、α-甘油磷酸、棕榈酸和硬脂酸等9种物质的水平在IFG病人中显著性升高，而甘油单棕榈酸酯和甘油单硬脂酸酯则显著性降低。进一步的相关性分析表明，2-酮基异己酸和硬脂酸与血糖呈正相关，而甘油单棕榈酸酯和甘油单硬脂酸酯则与血糖呈负相关，另外，在两类样本中具有显著性差异的11种代谢物的线性组合与血糖呈正相关。结果表明所发展的代谢组学方法能在考虑代谢物之间相互关系的基础上有效地筛选疾病的生物标志物。（第四章）
　　 四、应用基于PLS-DA的代谢组学方法筛选2型糖尿病潜在的生物标记物。首先采用基于GC/MS的代谢组学方法对健康组及2型糖尿病组血浆样本进行定性定量分析，随后采用PLS-DA筛选相关生物标记物。应用蒙特卡罗的思想随机得到各个代谢物所对应PLS-DA的回归系数，继而得到它们的分布，并由分布来决定代谢物水平的变化，继而筛选出2型糖尿病潜在的生物标记物。该方法为疾病生物标记物的筛选提供了一种新思路（第五章）
　　 五、将基于GC/MS的代谢组学方法应用于2型糖尿病强化治疗的药效评价及治疗相关生物标记物的筛选。采用PCA分析治疗后的代谢模式与治疗前以及健康对照的代谢模式，结果发现治疗后的代谢模式与治疗前具有明显差异，并有向健康组靠拢的趋势。PLS-DA的结果表明，乳酸、α-羟基异丁酸、磷酸、甘油单棕榈酸酯与甘油单硬脂酸酯等五种代谢物在2型糖尿病患者组中的水平显著性地高于健康组，而在治疗后则显著性地降低，因此可作为2型糖尿病强化治疗的潜在的生物标记物。该方法为建立基于代谢组学的药效评价平台以及筛选药物治疗相关的生物标记物提供了基础。（第六章）
　　 六、为了寻找儿童肥胖与2型糖尿病之间的代谢联系，采用基于GC/MS的代谢组学方法，并结合ULDA和CCA等多元统计方法，分析了儿童肥胖与2型糖尿病代谢组学结果之间的联系，以及它们分别与相对应临床参数的关系。结果表明，WHR在儿童肥胖与2型糖尿病中分别具有比常规采用的BMI和空腹血糖(fasting blood sugar,FBS)具有更重要的作用，并且亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸与苏氨酸等四种代谢物在儿童肥胖与2型糖尿病相关的代谢紊乱中均具有重要的作用。该方法为从代谢组学的角度寻找儿童肥胖与2型糖尿病的联系，以及预防儿童肥胖发展成为2型糖尿病提供了有价值的信息。