5-Aza-CdR对人膀胱癌细胞株T24细胞生物学行为的影响及其分子生物学机制的研究

摘要

背景：膀胱癌是我国泌尿系统最常见的肿瘤，其中移行细胞癌(BTCC)占90％以上，严重危害人民健康。近年来我国部分城市肿瘤发病率报告显示，BTCC发病率有增高的趋势。大部分膀胱癌患者确诊时处于分化良好或中等分化的非肌层侵润性膀胱癌，可予保留膀胱手术并行膀胱内灌注化疗或免疫治疗，但术后容易复发，复发率高达50％～70％，其中10％～15％的病例恶性程度增高，易发展为浸润性膀胱癌。因此探索膀胱癌有效治疗的新方法已经成为临床上迫切需要解决的实际问题，而且一直是研究的热点与难点。
　　 恶性肿瘤为多因素、多阶段形成，其生物学特性表现为浸润性生长和转移，其发生机制在于细胞内部基因结构和功能发生了异常改变。在肿瘤发生多阶段癌变过程中，癌基因的激活和/或抑癌基因的失活为其中两个重要的分子学事件。现代肿瘤理论认为，在肿瘤的形成过程中包含两大类机制，一个是遗传学层面，即通过DNA核苷酸序列改变而形成突变；另一个就是表观遗传学层面，其研究的对象是基因表达的变化，这种变化可通过减数分裂遗传，不涉及有关基因DNA序列的改变。尽管不存在DNA核苷酸序列的改变，但通过DNA自身化学修饰方式从转录水平影响基因的表达，调控DNA功能，此机制在肿瘤的形成过程中越来越受到重视。DNA甲基化是目前表观遗传学上研究最深入的一种机制，是由甲基转移酶介导，将胞嘧啶变为5-甲基胞嘧啶的一种反应。肿瘤学研究发现，启动子区高甲基化异常是导致许多肿瘤抑制基因表达异常的内在机制。相对于引起结构异常的基因变异机制，属于表观遗传学机制的DNA甲基化模式随着细胞分裂可得到稳定复制和遗传，而同时甲基化的异常更易于被逆转，在癌变过程中，使异常甲基化逆转，特别是在癌变早期阶段的转变，对于肿瘤的防治尤为重要。由于高度甲基化而暂停表达的抑癌基因，如果能应用去甲基化制剂逆转甲基化的异常状态，使之重获表达，理论上即可发挥其抑制肿瘤细胞生长的功能。
　　 DNA甲基化调节基因表达，某些抑癌基因在肿瘤发生中存在着高甲基化而失活均已得到广泛证实。本研究选用5-氮-2’-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)作为去甲基化制剂来处理膀胱移行细胞癌细胞株T24。5-Aza-CdR是一种嘧啶类似物，由对2’-脱氧胞嘧啶第5位碳置换为氮获得，在复制过程中的DNA分子结合阶段，该制剂可与DNA甲基转移酶1(DNMT1)形成一个共价复合物，抑制该酶的转移活性，从而形成低甲基化的子链，实现去甲基化功能。体外实验已经证实DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR通过去甲基化作用可使多种含有启动子CpG岛的高甲基化的抑癌基因重新表达，从而恢复其抑癌功能，这一研究结果对于肿瘤的基因治疗提供了一个新的思路。膀胱癌在临床治疗中应用相应的去甲基化制剂以改变膀胱癌癌细胞的生物学行为，目前尚未见报道。膀胱肿瘤抑制基因的失活进而导致蛋白表达下降的机制尚不是十分明确，国内的系统研究甚少。
　　 第一章 XAF1与XIAP在膀胱移行细胞癌中的表达及其相关性
　　 目的：研究BTCC患者中凋亡抑制蛋白XIAP和XIAP相关因子1(XAF1)的表达及其临床意义。
　　 方法：用免疫组织化学法检测XIAP与XAF1在在56例BTCC和38例癌旁组织中的表达情况，并分析其与BTCC临床病理因素的关系。同时取正常膀胱组织18例做对照。
　　 结果：膀胱癌组织中XIAP积分为7.13±3.11，明显高于膀胱癌癌旁组织中的2.28±1.54和正常膀胱组织的1.43±1.48(P<0.01)；XAF1积分为3.04±2.61，明显低于癌旁组织中的7.32±3.64和正常膀胱组织的8.44±3.04(P<0.01)。癌旁组织与正常膀胱组织比较，XIAP积分差别有统计学意义(P<0.01)，XAF1积分差别无统计学意义(P>0.05)。XIAP积分在G3为9.82±4.30，G2的表达为7.65±2.01，G1的表达为4.82±2.21，组间比较有统计学差异(P<0.05)，XIAP积分与BTCC的病理分级呈正相关；XAF1积分在G3为0.85±0.99，G2的表达为2.66±2.20，G1的表达为4.24±2.04，组间比较有统计学差异(P<0.05)，XAF1积分与BTCC的病理分级呈显著负相关。复发膀胱癌组织中XIAP积分(8.46±4.52)高于初发癌组织(6.49±1.94)(P<0.05)。复发膀胱癌组织中XAF1积分(1.89±1.25)低于于初发癌组织(3.24±2.49)(P<0.05)。两者积分在患者的不同性别、年龄段、肿瘤临床分期的差异无统计学意义(P>0.05)。在BTCC组织中XIAP表达与XAF1表达有相关性(P<0.05)，呈负相关。
　　 结论：
　　 1.BTCC组织中XIAP的表达高于癌旁组织和正常膀胱组织，XAF1表达明显降低；
　　 2.XIAP的表达高低与BTCC的肿瘤病理分级明显相关，呈正相关，且复发肿瘤明显高于初发肿瘤；XA目的表达也与BTCC的肿瘤病理分级明显相关，呈负相关，而且复发膀胱癌明显低于初发肿瘤；
　　 3.在BTCC组织中XIAP表达与XAF1表达相关，呈负相关。
　　 第二章 5-Aza-CdR对膀胱癌T24细胞生物学行为及化疗敏感性的研究
　　 目的：探讨5-Aza-CdR对人膀胱癌T24细胞生物学行为的影响，即对细胞增殖和细胞凋亡的影响，及对其他化疗药敏感性的影响。
　　 方法：设定不同浓度的5-Aza-CdR作用于T24细胞，利用MTT法检测细胞增殖，流式细胞术检测T24细胞的凋亡指数；用MTT法检测单用化疗药组，与用5-Aza-CdR合用组对T24细胞抑制率的差异。
　　 结果：MTT法检测5-Aza-CdR(1uM，5uM，10uM，15uM，30uM，45uM)作用于T24细胞24h后，对T24细胞的抑制率分别为5.55％，13.27％，15.37％，18.52％，36.50％，44.62％；48h后分别为7.47％，17.86％，21.81％，27.50％，56.67％，67.47％；72后分别为13.45％，25.82％，30.81％，44.25％，64.80％，77.26％。各时间点不同浓度组组与对照组比较有统计学意义，并且呈明显的剂量效应关系(P<0.05)。同一浓度，抑制率与时间成正比，组间差异有统计学意义(P<0.05)。MTT检测不同浓度化疗药单用组及与5-Aza-CdR(1uM)合用组对T24细胞的抑制率差异。结果剂量相同的化疗药物，5-Aza-CdR处理后再用，其对细胞的抑制率明显提高(P<0.05)。流式细胞术检测其凋亡率，对照组的凋亡率是(0.52±0.03)％，5-Aza-CdR处理1uM组的凋亡率是(4.57±0.53)％，15uM处理组的凋亡率是(12.24±1.09)％，30uM处理组的凋亡率是(25.58±2.68)％；各浓度组与对照组的细胞凋亡率相比差异性显著(P<0.01)，随5-Aza-CdR浓度增加，细胞的凋亡率增大，呈剂量依赖性关系(P<0.01)。
　　 结论：
　　 1.5-Aza-CdR作用于T24细胞后，对T24细胞的生长有明显抑制作用，并且呈明显的时间剂量效应关系。
　　 2.5-Aza-CdR预处理后，化疗药E-ADM与MCC对肿瘤细胞的抑制作用明显增强。
　　 3.5-Az-CdR作用于 T24细胞后，明显诱导细胞凋亡，凋亡的诱导作用呈显著剂量依赖性。
　　 第三章 5-Aza-CdR抑制人膀胱癌T24细胞分子生物学机制的实验研究
　　 目的：探讨5-Aza-CdR抑制人膀胱癌T24细胞的分子生物学机制。
　　 方法：设定不同浓度的5-Aza-CdR作用于T24细胞48小时后，MSP检测XAF1启动子基因甲基化情况，RT-PCR检测T24细胞的XAF1、XIAP、NF-KBP65的mRNA表达，Western blot检测XAF1、XIAP、NF-KBP65蛋白的表达。
　　 结果：MSP检测T24细胞XAF1基因启动子处于甲基化状态，而在经过5-Aza-CdR(1uM，15uM，30uM)去甲基化处理后，该基因呈去甲基化状态。RT-PCR检测，XAF1 mRNA表达比值(XAF1/GAPDH)分别为，1uM组：0.278±0.003，15uM组：0.404±0.020，30uM组：0.478±0.012。与对照组(0uM)0.6760±0.050比较，表达下调，并且呈剂量依赖关系(P<0.01)；NF-KBP65 mRNA表达比值分别为，1uM组：0.364±0.015，15uM组：0.484±0.013，30uM组：0.778±0.018，与对照组：0.203±0.009比较基因的表达明显上调，并且呈剂量依赖关系(P<0.01)；XIAP mRNA各组的表达与对照组比较，无明显差异(P>0.05)。Western blot检测，各组细胞XAF1蛋白表达比值分别为：1uM0.285±0.003，15uM0.350±0.003，30uM0.554±0.001，明显低于对照组0.227±0.002(P<0.01)，XAF1基因在蛋白表达水平上随5-Aza-CdR浓度的增高表达逐渐上升，并且呈剂量效应关系(P<0.01)；NF-KBP65基因在蛋白表达比值：1uM组为0.262±0.005，15uM组为0.298±0.004，30uM组0.343±0.003与0uM组(0.195±0.002)比较有显著性差异(P<0.05)；XIAP基因在蛋白各组的表达与对照组比较，无明显差异(P>0.05)。
　　 结论：
　　 1.膀胱癌T24细胞启动子XAF1基因处于甲基化状态，经5-Aza-CdR处理后，呈去甲基化状态。
　　 2.5-Aza-CdR作用于T24细胞后，XAF1基因的表达上调，NF-KBP65基因的表达上调，并且均与5-Aza-CdR呈明显的剂量效应关系，XIAP基因表达无明显改变。
　　 3.5-Aza-CdR作用于T24细胞后，XAF1蛋白的表达上调，NF-KBP65蛋白的表达上调，并且均与5-Aza-CdR呈明显的剂量效应关系，XIAP基蛋白表达无明显改变。