蜕膜细胞中孕激素受体及TNF-α、IL-1β、NF-κB改变致自然流产的研究

摘要

不明原因自然流产的发生与细胞因子、免疫系统、激素及其受体的调控之间的相互作用越来越受到重视，这一系列的因素与子宫内膜的正常蜕膜化、孕囊的植入和胚胎的正常发育均有密切的关系。在正常妊娠中，孕激素是维持妊娠的重要激素，孕激素主要通过孕激素受体(PR)起作用，蜕膜组织中要有一定的孕激素受体(PR)量才能对激素产生正常的反应。受体数量减少或功能减退，会影响相应的激素发挥其生理功能。人们发现对习惯流产病人单用孕激素或绒毛膜促性腺激素治疗并未获得理想的保胎效果，所以在孕激素补足后仍然发生流产的原因是国内外研究的热门课题。
　　 炎症因子是导致流产的重要因素之一，其引起流产的机制是目前研究的重要方向。已经有报导许多炎性细胞因子参与流产、早产、分娩启动等生理或病理过程，肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、核转因子κB(NF-κB)等是目前研究较多的细胞因子。
　　 细菌脂多糖(LPS)是革兰阴性菌细胞壁外膜中的重要组成成分，能促进TNF-α、IL-1β、NF-κB在细胞中的表达。近几年的研究发现NF-κB在哺乳动物的生殖过程中可能参与着床前胚胎的发育、着床、蜕膜化、分娩等多个生殖环节。白细胞介素-1β(IL-1β)在激活NF-κB转录活性的同时会抑制PR的转录活性。肿瘤坏死因子-a(TNF-α)则是诱导IL-1β产生的强刺激剂。
　　 我们通过研究自然流产患者的蜕膜细胞中孕激素受体(PR)和肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素1(IL-1β)、核转录因子κB(NF-κB)等的表达情况，与正常妊娠蜕膜细胞中比较存在明显的差异；再进行体外培养原代蜕膜细胞，研究细菌脂多糖(LPS)作用后的蜕膜细胞中PR的表达情况，进一步证实感染导致孕激素受体减少是引起自然流产的主要原因之一。
　　 本研究分为三部分，第一部分，采用RT-PCR方法研究自然流产和正常妊娠蜕膜细胞中孕激素受体mRNA含量；采用原位杂交免疫组化法研究孕激素受体(PR)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、核转录因子κB(NF-κB)等在自然流产和正常妊娠蜕膜细胞中的蛋白表达差异。第二部分，体外培养原代蜕膜细胞，建立无血清细胞模型；在体外培养的蜕膜细胞中加入不同浓度脂多糖(LPS)，模拟妊娠革兰阴性菌感染，从光镜下和电子显微镜下观察感染后蜕膜细胞生长抑制率和细胞超微结构的改变。第三部分，取不同浓度脂多糖(LPS)作用的蜕膜细胞，用RT-PCR方法研究PR、TSF-α、IL-1β、NF-κB mRNA表达差异；同时提取蛋白质，用蛋白印迹法研究PR和NF-κB的蛋白质表达差异，进一步证实脂多糖可通过引起炎症因子的增加而使孕激素受体的表达下调，为不明原因自然流产的治疗提供新的思路。
　　 第一部分孕激素受体改变在自然流产中的研究。
　　 目的：
　　 测定孕激素受体mRNA和孕激素受体及细胞因子TNF-α、IL-1β、NF-κB蛋白质在自然流产和正常妊娠蜕膜细胞中的表达差异。
　　 方法：
　　 收集自然流产组病例30例作为研究组，另有正常早孕人工流产组病例30例作为对照组，应用逆转录-聚合酶链反应(RZ-PCR)方法从转录水平检测两组子宫蜕膜细胞中的PR mRNA含量差异。
　　 应用原位杂交免疫组化方法检测PR、TNF-α、IL-1β、NF-κB蛋白质在两组蜕膜细胞中的表达差异，分析PR与TNF-α、IL-1β、NF-κB之间的相互关系，研究PR对妊娠的影响。
　　 结果：
　　 1.研究组蜕膜细胞中PR mRNA含量比对照组明显减少(P<0.05)。2.研究组蜕膜细胞的PR免疫组化染色阳性标本百分率低于对照组，两组间百分率比较无统计学差异(P>0.05)，但两组间平均染色分值比较有统计学差异(P<0.05)；3.研究组蜕膜细胞中 TNF-α、IL-1β和NF-κB免疫组化染色阳性百分率均高于对照组，两组间比较均有统计学差异(P<0.05)；4.PR的表达与NF-κB的表达呈负相关性，(r=-0.628，P<0.05)，NF-κB的表达与 TNF-α、IL-1β的表达呈正相关(P<0.05)。
　　 结论：
　　 1.与正常妊娠相比较，自然流产蜕膜细胞中PR mRNA表达减少。
　　 2.与正常妊娠相比较，自然流产蜕膜细胞中PR蛋白表达减少；
　　 3.自然流产蜕膜细胞中TNF-α、IL-1β与NF-κB蛋白表达增加；
　　 4.自然流产蜕膜NF-κB的蛋白表达与PR的蛋白表达呈负相关。
　　 第二部分脂多糖对体外培养蜕膜细胞损伤的研究。
　　 目的：
　　 培养原代人蜕膜细胞，建立体外人蜕膜细胞模型，加入不同浓度的脂多糖(LPS)，模拟妊娠期革兰阴性细菌感染，研究脂多糖对体外培养蜕膜细胞的损伤。
　　 方法：
　　 获取正常妊娠6～8周的蜕膜组织，采用复合酶消化法全组分细胞培养，细胞传代自然增殖法纯化蜕膜基质细胞，用免疫细胞化学染色方法和荧光免疫法检测细胞的垂体泌乳素(PRL)表达，进行细胞特征学鉴定，建立体外人蜕膜细胞模型。在此模型上加入不同浓度的LPS，使终浓度分别为25 ng/ml，50 ng/ml，100 ng/ml，200 ng/ml，培养24h、48h、72h后，应用MTT法测得感染后蜕膜细胞生长抑制率，48h后光镜和电子显微镜下观察细胞结构的改变。
　　 结果：
　　 细胞培养成功，原代培养镜下可见几种细胞成分，绝大部分为单纯蜕膜基质细胞(decidual stromal cell，DSC)，呈梭形或不规则的星形，核呈卵圆形，大而圆，镜下形态一致。PRL免疫细胞化学和荧光免疫法证实90％的培养细胞呈阳性，显示DSC已经得到较高的纯化，且其分泌功能仍保持正常。加入不同浓度的LPS后，采用MTT法测定细胞的抑制率，发现在24h时段下，研究组与对照组比较，各浓度的LPS对DSC的抑制率无明显影响，P值大于0.05，无统计学意义；而作用48h、72h以后，细胞的抑制率则有明显不同，加入高浓度(200 ng/ml)LPS的研究组抑制率为16.88％，明显高于低浓度(25 ng/ml)LPS的研究组3.96％；在光镜下，低浓度LPS对蜕膜细胞的影响几乎看不到，高浓度的LPS作用DSC后有轻微改变，而透射电镜下观察到对照组细胞突触清晰可见，微绒毛不多，核膜核仁完整，染色质分布均匀，研究组可见细胞体积缩小，表面突起增多，胞浆内空泡增多，线粒体水肿等细胞凋亡改变。而且随着LPS浓度的增加，细胞器损伤更明显，出现细胞固缩，胞浆水肿或长满绒毛，核固缩，核膜破裂、裂解。
　　 结论：
　　 1.建立体外人蜕膜细胞模型成功；
　　 2.不同浓度LPS作用于体外培养的蜕膜细胞48小时和72小时，细胞的抑制率明显增加，且浓度增加细胞的抑制率；
　　 3.不同浓度LPS可以使蜕膜细胞发生明显的超微结构改变，且随LPS的浓度逐渐增加细胞器损伤逐渐加重。
　　 第三部分 LPS致蜕膜细胞中孕激素受体改变的研究。
　　 目的：
　　 研究LPS感染体外培养的蜕膜细胞中孕激素受体和细胞因子核酸和蛋白质的表达差异。
　　 方法：
　　 取第三代蜕膜细胞，加入LPS使终浓度分别0ng/ml(对照组)，25ng/ml(研究1组)，50ng/ml(研究2组)，100ng/ml(研究3组)，200ng/ml(研究4组)，在加药48h后用逆转录-聚合酶链法(RT-PCR)测PR、TNF-α、IL-1β、NF-κB的mRNA水平表达差异；用蛋白印迹法(Western Blot)从蛋白质水平分析蜕膜细胞受LPS作用后PR、NF-κB表达的差异。
　　 结果：
　　 1.不同浓度LPS作用后，PR的mRNA出现较明显的递减趋势，研究组1、2、3和对照组比较，PR mRNA有减少，但改变不明显(P>0.05)；研究组4与对照组比较PR mRNA明显减少(P<0.05)，且与研究组1、2、3组比较也明显减少(P<0.05)。2.不同浓度LPS作用，TNF-α、IL-1β、NF-κB的mRNA均出现较明显的递增趋势，研究组和对照组比较TNF-α、IL-1β、NF-κB的mRNA明显增加(P<0.05)，研究组各组间比较TNF-α、IL-1β、NF-κB的mRNA丰度有增加，但改变不明显(P>0.05)。3.研究组的蜕膜细胞PR蛋白表达丰度显著低于对照组(P<0.05)，且随着LPS的浓度逐渐增加，PR蛋白的表达也逐渐减弱；研究组的蜕膜细胞NF-κB蛋白表达丰度显著高于对照组(P<0.05)，且随着LPS的浓度逐渐增加，NF-κB蛋白的表达也逐渐增加。
　　 结论：
　　 1.不同浓度LPS可以诱导蜕膜细胞PR mRNA出现明显的递减趋势
　　 2.不同浓度LPS可以诱导蜕膜细胞TNF-α、IL-1β、NF-κB mRN均出现较明显的递增趋势。
　　 3.随着LPS的浓度逐渐增加，蜕膜细胞PR蛋白的表达逐渐减弱，NF-κB蛋白的表达则逐渐增强。