GnRH拮抗剂Cetrorelix在子宫内膜癌治疗中作用机制研究

摘要

目的；本研究通过用不同浓度的GnRH拮抗剂cetrorelix作用于体外培养的人子宫内膜癌ishikawa细胞株，观察作用不同时间后癌细胞的生长抑制率和细胞周期、凋亡率的变化，探讨cetrorelix对子宫内膜癌细胞的增殖、凋亡抑制机制。通过比较GnRH拮抗剂cetrorelix处理前后人子宫内膜癌细胞蛋白质表达谱的变化，从整体蛋白质水平来揭示GnRH拮抗剂作用于子宫内膜癌细胞的分子机制，也为临床上应用GnRH拮抗剂治疗子宫内膜癌提供理论依据。
　　 方法：1)联合应用组织芯片和免疫组化技术检测不同分化程度不同临床期别子宫内膜癌组织中促性腺激素受体(GnRH-R)的表达；2)MTT法检测不同浓度GnRH拮抗剂cetrorelix单用或与紫杉醇联用对子宫内膜癌ishikawa细胞生长抑制率，确定cetrorelix对子宫内膜癌细胞增殖抑制的最佳浓度；流式细胞技术检测作用后细胞周期与凋亡率变化；3)利用固相梯度双向凝胶电泳技术建立药物处理前后细胞总蛋白双向凝胶电泳图谱，经PDQuest软件分析，选取差异表达的蛋白质点进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析，获得蛋白质点肽质量指纹图谱，Mascot软件搜索MSDB数据库鉴定蛋白质。4)采用Westernblot技术对部分差异表达蛋白质进行验证。
　　 结果：1)正常子宫内膜组织GnRH-R蛋白全部表达为阳性，阳性表达率为100％(7/7)。子宫内膜癌组织中GnRH-R蛋白阳性表达率为94％(59/63)，二者差异无显著性(P>0.05)。不同期别子宫内膜癌组织中GnRH-R蛋白阳性表达率分别为Ⅰ期97％(55/57)，Ⅱ期80％(4/5)，Ⅲ期GnRH-R蛋白表达为阴性。不同分化程度子宫内膜腺癌组织中GnRHR蛋白阳性表达率Ⅰ级94％(33/35)，Ⅱ级94％(17/18)，Ⅲ级为86％(7/8)。不同临床期别和不同病理分级中子宫内膜癌组织中GnRH-R蛋白阳性表达率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。2)GnRH拮抗剂对人子宫内膜癌ishikawa细胞的增殖具有抑制作用，GnRH拮抗剂cctrorelix抑制子宫内膜癌ishikawa细胞生长呈时间和剂量依赖(P<0.05)，随药物浓度增加和作用时间延长，抑制作用越明显。10-5mol/L Cetrorelix作用72h时达最大抑制率。联合使用cetrorelix和紫杉醇对子宫内膜癌ishikawa细胞生长的抑制优于二者单用。3)流式细胞仪检测显示10-5mol/L Cetrorelix作用72h可引起子宫内膜癌ishikawa细胞的生长周期停滞于S期，细胞凋亡率增加；4)经双向凝胶电泳和图像分析，找出差异蛋白质点53个(差异在2倍以上且在3组中均有相同的差异)，其中在处理组表达上调的12个，表达下调的33个，仅在处理组中表达的3个，仅在对照组中表达的5个。筛选31个蛋白质点作为差异表达的蛋白质点进行质谱分析，有21个蛋白得到鉴定，经质谱鉴定的蛋白包括7个处理后表达下调的蛋白即：α-烯醇化酶(ENO1)、热休克蛋白90(HSP90)、蛋白质二硫键异构酶(PDIA6)、抑制素(Prohibitin-2)、丝裂原活化蛋白激酶(MAP2K2)、真核翻译延伸因子1A2(EEF-1A2)、膜联蛋白(annexinAl)。5)应用Western Blot技术对Annexin Al和α-烯醇化酶进行验证，Annexin Al和α-烯醇化酶在处理组中表达下调，与蛋白质组学的结果一致。
　　 结论：GnRH受体可能在子宫内膜癌的发生和发展过程中起一定作用。GnRH拮抗剂cetrorelix能有效抑制子宫内膜癌细胞生长，可能通过参与细胞周期的调控，诱导细胞凋亡发挥作用，并可增加肿瘤细胞对紫杉醇的敏感性。从蛋白质组学研究中鉴定的蛋白质的功能中，发现GnRH拮抗剂cetrorelix可能通过影响细胞能量代谢和干预细胞骨架、转录和翻译、细胞内信号传导、凋亡等多条途径发挥作用。这一结论为进一步了解GnRH拮抗剂的作用机制以及临床应用GnRH拮抗剂预防和治疗子宫内膜癌提供了理论和实验依据。