人多能性干细胞向生殖细胞诱导分化的研究

摘要

第一章携带生殖细胞特异基因荧光报告系统的人类胚胎干细胞系的构建和诱导分化研究
　　 目的：构建携带生殖细胞特异基因VASA荧光报告系统的人胚胎干细胞稳定系，利用稳定系优化生殖细胞体外诱导分化的体系。
　　 方法：通过慢病毒感染的方法构建chHES137-VASA-EGFP荧光报告基因细胞系，并进一步使用单克隆法筛选具有相同基因型的亚系。利用构建成功的细胞系进行向原始生殖细胞诱导分化的研究。挑取传代后d5～6天完全未分化的chHES137-VASA-EGFP克隆制备拟胚体(EB)。在Wnt3a(30ng/ml)和BMP4(100ng/ml)联合作用下诱导EBs向原始生殖细胞分化。取诱导分化后d12诱导细胞作流式分析EGFP阳性细胞群，并分选收集EGFP阳性细胞和EGFP阴性细胞，进行生殖细胞发育相关基因的RT-PCR检测和VASA原位染色。进一步，利用以上构建成功细胞系比较不同诱导基础培养基对诱导分化效率的影响。
　　 结果：chHES137-VASA-EGFP在诱导过程中有绿色荧光蛋白表达。FACS检测诱导第12天细胞的EGFP阳性率为9.8±0.2，生殖细胞发育相关基因VASA、DAZL和SCP3在流式分选后EGFP阳性细胞中均有表达，EGFP阴性细胞中均未见表达。诱导第12天细胞的原位染色显示表达EGFP绿色荧光的细胞与VASA抗体标记的红色荧光细胞有部分重叠，提示EGFP绿色荧光的区域即为细胞内源性VASA表达部位。FACS检测不同基础培养基体系下生殖细胞的分化效率，D/F12-EB组EGFP阳性率为9.7±1.2，明显高于其它三种培养体系，并且生殖细胞发育相关基因在D/F12-EB组有表达，其它组表达不明显。
　　 结论：构建的chHES137-VASA-EGFP报告细胞系能有效示踪体外诱导分化过程中的原始生殖细胞。D/F12-EB基础培养基较其它培养基更能支持生殖细胞的体外分化，Wnt3a和BMP4能有效促进原始生殖细胞的形成。
　　 第二章卵巢早衰的诱导性多能干细胞(POF-iPS)、正常的诱导性多能干细胞(hEFs-iPS)和人胚胎干细胞向生殖细胞诱导分化的比较研究
　　 目的：构建POF-iPS、hEFs-iPS的VASA-EGFP荧光报告细胞系，比较其与chHES137-VASA-EGFP向生殖细胞分化能力的差异。
　　 方法：通过慢病毒感染的方法构建携带生殖细胞特异标记的POF-iPS-VASA-EGFP和hEFs-iPS-VASA-EGFP稳定系。运用chHES137-VASA-EGFP向生殖细胞诱导分化的体系，比较POF-iPSVASA-EGFP、hEFs-iPS-VASA-EGFP和chHES137-VASA-EGFP三株不同细胞系向生殖细胞诱导分化能力的差异。收集第12天诱导细胞，FACS检测诱导效率。
　　 结果：POF-iPS-VASA-EGFP、hEFs-iPS-VASA-EGFP和chHES137-VASA-EGFP在向生殖细胞诱导分化的过程中均有绿色荧光蛋白表达。三株细胞系诱导效率有差异，POF-iPS-VASA-EGFP阳性率为3.2％，hEFs-iPS-VASA-EGFP阳性率为4.6％，chHES137-VASA-EGFP阳性率为7.6％。
　　 结论：POF-iPS-VASA-EGFP、hEFs-iPS-VASA-EGFP和chHES137-VASA-EGFP三株细胞系向生殖细胞分化的能力存在差异。

目录

文摘

英文文摘

项目基金资助

英文缩写注解

实验技术路线图

第一章 携带生殖细胞特异基因荧光报告系统的人类胚胎干细胞系的构建和诱导分化研究

前言

1．材料与试剂

1.1 细胞

1.2 试剂

1.3 主要仪器

1.4 引物

2．方法

3 实验结果

4 讨论

5 结论

第二章 诱导性多能干细胞和人胚胎干细胞向生殖细胞诱导分化的比较研究29

前言

1.材料和试剂

2．方法

3 实验结果

4．讨论

5．总结

参考文献

综述 原始生殖细胞发生的机制研究

参考文献

致谢