球药隔重楼甾体皂甙生物合成相关功能基因的克隆与组织表达分析

摘要

甾体皂甙是一类药用价值较高的次生代谢产物，探索和研究它的合成途径，并实现其代谢调控，对促进中医药现代化发展具有重大意义。球药隔重楼(Paris fargesii Franch)是百合科重楼属的一种，它具有清热解毒、止血、止痛的功效，主要药效成分是甾体皂甙。甾体皂甙是通过甲羟戊酸途径合成的，而3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)是该途径的第一个限速酶。
　　 本论文首次成功提取了球药隔重楼的总RNA，通过比对其他种属HMGR基因，找出它们的同源保守序列，扩增出目的基因的保守片段、3’和5’cDNA拼接，克隆得到了HMGR的全长cDNA，命名为PfHMGR，大小为1973 bp，编码576个氨基酸。PfHMGR的生物信息学分析显示，其蛋白分子量约为61 kDa，理论等电点为6.64，与其他植物的HMGR基因具有较高的同源性，有两个HMG-CoA结合位点和两个NADP(H)结合位点，包括两个跨膜区域和三个催化区域。
　　 本论文首次构建了PfHMGR基因的大肠杆菌表达载体并将其转化到大肠杆菌中表达，其表达鉴定结果显示PfHMGR能够替代AtIPI基因的功能，促进了类胡萝卜素的积累，即PfHMGR在大肠杆菌中实现了表达。
　　 以18S基因作为内参照，采用Real-time PCR方法扩增了甾体皂甙的生物合成途径中其他三个功能基因IPPI、FPS、SS的部分序列，研究了它们在不同组织中的表达差异，结果显示这三个基因在根、茎、叶中均有表达。IPPI在茎中的表达量最高，根中最低，FPS也是在茎中表达量最高，叶子中最低，而SS在根中的表达量最高，叶中最低。另外，通过one-step PCR检测出PfHMGR基因在根、茎、叶三个组织部位都有表达，但在根中的表达量高于茎中的表达量，而叶中的表达量最低。PfHMGR这样的表达差异很有可能与根部的生长以及甾体皂甙的积累成正相关。