Trop2调控头颈鳞癌侵袭转移及化疗敏感性的分子机制研究

摘要

头颈鳞癌的早期转移及对化疗药物不敏感一直是影响患者疗效的重要原因，因此寻找头颈鳞癌转移和化疗增敏有关的关键分子及其分子机制一直是人们研究的重点和热点。本文将分章讨论一新颖分子-肿瘤相关钙离子信号转导因子2(Trop2)对头颈鳞癌细胞转移及其对化疗敏感性的作用及其调控的分子机制。
　　 第一章 Trop2在头颈鳞癌中的异常表达及其临床意义
　　 目的：分别在RNA水平和蛋白水平探讨头颈鳞癌组织中Trop2的表达与肿瘤T分期、临床分期和有无淋巴结转移等临床病理学参数的关系，并检测。Trop2在头颈鳞癌细胞系中的表达水平。
　　 方法：采用荧光定量PCR方法检测53例头颈鳞癌组织、25例癌旁组织的新鲜标本；采用免疫组织化学的方法检测87例头颈鳞癌组织、20例癌旁组织的石蜡组织标本，分析其在头颈鳞癌组织中的表达与临床病理学参数的关系。采用Western blot实验方法检测Trop2在头颈鳞癌细胞系中的表达。SPSS17.0统计软件对实验数据进行统计分析。
　　 结果：
　　 1)Trop2 mRNA在头颈鳞癌组织中相对表达量明显高于癌旁组织中的表达量(P<0.001)，Trop2 mRNA的过表达表达与头颈肿瘤的临床分期、病理分级、淋巴结转移等因素相关(P<0.001)，而与患者年龄无关(P>0.05)。
　　 2)Trop2蛋白在头颈鳞癌组织中的表达强度明显高于癌旁粘膜组织(P<0.01)，Trop2蛋白的过表达与头颈肿瘤的临床分期、病理分级、淋巴结转移等因素相关(P<0.01)，而与患者年龄无关(P>0.05)。
　　 3)Trop2蛋白在头颈鳞癌细胞株中的表达量由高到低依次为Tu686>M4>M2>Hep2>Tu212。
　　 结论：以上结果提示检测Trop2的表达与头颈鳞癌的发生、发展和淋巴结转移相关，为头颈鳞癌转移和化疗增敏机制的研究提供了新的线索。
　　 第二章构建沉默Trop2的shRNA的质粒载体和建立Trop2-shRNA质粒稳定转染的细胞株
　　 目的：利用RNA干扰技术构建针对Trop2基因的shRNA质粒载体Trop2-shRNA，建立稳定转染Trop2-shRNA的细胞株。
　　 方法：使用pGCsilencerTM H1/Neo/GFP/RNAi载体构建表达shRNA对Trop2基因的RNA干扰的质粒。采用脂质体转染法将构建的Trop2-shRNA及对照no-targe-shRNA质粒瞬时转染高表达Trop2的M4和Tu686细胞，通过荧光定量PCR、Western blot及CCK-8法检测效果。筛选出有效质粒后，应用G418筛选转染细胞，建立稳定沉默Trop2基因的M4和Tu686细胞株。
　　 结果：
　　 1)经过质粒DNA测序，pGCsilencerTM H1/Neo/GFP/RNAi(1、2、3号)构建成功。
　　 2)瞬时转染后检测显示TACSTD2-RNAi-3质粒为RNA干扰效果最强的质粒。其在Tu686与M4细胞Trop2 mRNA沉默效率分别为56.4％和52.7％，在Tu686与M4细胞Trop2蛋白沉默率分别为49.7％和45.0％。该质粒对Tu686与M4细胞的生长抑制率分别为27.84±4.15％和25.08±3.73％。
　　 3)稳定转染TACSTD2-RNAi-3质粒后，在Tu686与M4细胞Trop2 mRNA沉默效率分别为81.5％和76.2％，Trop2蛋白沉默率分别为75.7％和72.8％。
　　 结论：成功构建了沉默Trop2的shRNA的质粒载体和建立Trop2-shRNA质粒稳定转染的Tu686与M4细胞株，为后续的实验奠定了基础。
　　 第三章沉默Trop2基因对头颈鳞癌细胞侵袭转移能力的影响及可能机制的探讨
　　 目的：探讨沉默Trop2基因后，头颈肿瘤细胞侵袭转移能力与上皮-间质转化(EMT)相关基因表达的改变
　　 方法：CCK-8法检测沉默Trop2基因后对Tu686细胞生长增殖的影响，Transwell细胞侵袭试验与细胞划痕试验分别检测稳定转染Trop2-shRNA质粒的Tu686细胞及其对照细胞。Western blot检测实验组和对照组细胞中E-Cadherin与β-catanin表达的变化。
　　 结果：
　　 1)稳定转染Trop2-shRNA质粒的Tu686细胞在24、48、72小时的细胞抑制率明显高于对照组，分别为14.3±2.1％，28.7±3.6％、35.4±3.4％，对照组细胞在24、48、72小时的抑制率分别为3.3±1.4％、5.7±1.3％、4.8±1.1％(P<0.001)。
　　 2)细胞划痕试验显示Trop2-shRNA Tu686细胞在48小时迁移细胞数为39±7.7，明显低于对照组no-target-shRNA Tu686细胞68±17.4，细胞迁移降低率为42.6％(P<0.01)。
　　 3)Transwell细胞侵袭试验显示Trop2-shRNA Tu686细胞侵袭数为153±20.6，明显低于对照组no-target-shRNA Tu686细胞侵袭数247±36.4，侵袭能力降低为38.1％(P<0.01)。
　　 4)Western blot检测发现沉默Trop2基因后能同时增强E-Cadherin的表达，然而，β=catenin的表达无明显改变。
　　 结论：沉默Trop2的表达能减弱头颈鳞癌细胞的生长增殖及侵袭转移能力，Trop2可能对EMT相关蛋白E-Cadherin的表达起到了调控作用。4
　　 第四章沉默Trop2基因对头颈鳞癌细胞化疗敏感性的影响
　　 目的：探讨沉默Trop2基因后，头颈鳞癌细胞化疗敏感性的改变
　　 方法：稳定转染Trop2-shRNA质粒的Tu686和M4细胞及其对照细胞均予以不同浓度梯度的紫杉醇或顺铂处理48小时后，使用CCK-8法检测细胞生长增殖情况。使用IC30的药物浓度处理Tu686和M4细胞，24小时后，使用Tunnel法和AnnexinⅤ法检测细胞凋亡情况。
　　 结果：
　　 1)紫杉醇作用后Trop2-shRNA tu686细胞的细胞存活率明显低于对照组 no-target-shRNA tu686细胞，实验组IC50值(9.931±0.876)×10-8明显低于对照组的IC50值(9.484±0.744)×10-7(P<0.001)。
　　 2)紫杉醇作用后Trop2-shRNA M4细胞的细胞存活率明显低于对照组no-target-shRNA M4细胞，实验组IC50值(1.959±0.0176)×10-7明显低于对照组的IC50值(1.396±0.174)×10-6(P<0.001)。
　　 3)顺铂作用后，实验组与对照组tu686细胞及M4细胞的细胞存活率无明显差异。(P>0.05)。
　　 4)紫杉醇作用后，Tunnel检测法显示Trop2-shRNA tu686细胞凋亡比例为44.3±3.4％，明显高于对照组细胞凋亡比例28.7±2.6％(P<0.01)。AnnexinⅤ流式细胞检测法显示Trop2-shRNAtu686细胞凋亡比例为31.39±2.83％，明显高于对照组细胞凋亡比例14.67±2.77％(P<0.01)。
　　 5)紫杉醇作用后，Tunnel检测法显示Trop2-shRNA M4细胞凋亡比例为42.8±4.6％，明显高于对照组细胞凋亡比例27.9±3.1％(P<0.01)。AnnexinⅤ流式细胞检测法显示Trop2-shRNAM4细胞凋亡比例为33.75±3.47％，明显高于对照组细胞凋亡比例14.72±1.94％(P<0.01)。
　　 结论：沉默Trop2的表达能明显增强头颈鳞癌细胞对紫杉醇的敏感性，但对顺铂的化疗敏感性无显著影响。