Notch信号通路活化在肾缺血-再灌注损伤中的作用及冬虫夏草肾保护作用机制的研究

摘要

研究背景：急性肾衰竭(acute renal failure，ARF)是一种常见的临床危急重症，常以氮质血症、水电解质和酸碱平衡紊乱及全身各系统并发症为主要临床表现，严重危害人类健康。近年来，尽管ARF的基础和临床研究取得了较大进展，但其发病率和死亡率仍居高不下，其主要原因是ARF发病原因错综复杂，发病机制迄今尚未明确，特别是很多ARF患者早期症状不明显，直致病情发展到一定程度才出现血清肌酐升高，让临床医生失去了适时救治的良好机会。因此，近年来学者们将急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)的概念引入肾脏病和急诊医学领域，趋向将ARF更称为急性肾损伤，这样更有利于临床医生早期诊断和治疗AKI，即在肾功能开始下降、甚至肾脏组织学有损伤、生物标志物改变而GFR尚正常的阶段将之识别并及早干预治疗，以避免ARF的发生。如何早期识别和诊断AKI，何种机制和学说能更好的解释AKI的发生发展过程已成为当今肾脏病领域研究的热点。
　　 肾缺血-再灌注损伤(Ischemia reperfusion injury，IRI)是AKI的主要发病机制之一，这已被学者们的研究证实。而凋亡和炎症在肾IRI的发生发展中起重要作用。IRI可引起肾小球内皮细胞功能障碍，继而内皮细胞表达细胞间粘附分子增多，介导血流中的有形成分如中性粒细胞、单核细胞粘附至血管内皮细胞，这些细胞都可以通过各种网络信息调控并刺激这些细胞分泌TNF-α、IL-2、IL-6、IL-8等炎症因子和MCP-1等化学趋化因子，通过这些炎性因子再激活炎症的级联反应，导致肾组织炎症反应发生，最终引起AKI。肾小管上皮细胞，作为肾脏的固有细胞，在肾IRI的环境下，其本身既可以因为缺血而受到损伤，也可以在某些因子的影响下转化为炎症细胞，分泌TNF-α、IL-2、IL-6等炎症因子，参与了AKI的发生。实验研究表明，TNF-α、IL-1、IL-6等炎症因子的拮抗剂通过抑制IRI相关的炎症和肾小管上皮细胞凋亡发挥肾保护作用，提示TNF-α、IL-1、IL-6等炎症因子在AKI发生和治疗中起了十分重要的作用。
　　 本组前期研究已证明冬虫夏草(Cordyceps Sinensis，CS)对糖尿病肾病、高血压肾损伤模型鼠具有良好的肾保护作用，CS是否可以通过影响肾IRI诱导的炎症和氧化应激发挥肾保护作用，其作用靶点是否与抑制Notch信号通路活化有关，目前国内外未见报道。本研究拟以I/R大鼠模型和抗霉素A与肾小管上皮细胞共培养模拟的体外的I/R模型为研究对象，一方面观察I/R损伤时IL-6、TNF-α、MCP-1和HIF-1α的表达状况和Notch2/hes-1信号转导通路是否被激活；另一方面用Notch信号通路关键酶()-secretase抑制剂和冬虫夏草进行干预实验，其目的是：
　　 1.观察肾I/R是否可上调肾小管上皮细胞IL-6、TNF-α、MCP-1和HIF-1α的表达，从而证实肾IRI存在炎症和氧化应激过程。
　　 2.观察肾I瓜是否可激活Notch2/hes-1信号通路，活化的Notch2/hes-1信号通是否参与IL-6、TNF-α、MCP-1和HIF-1α的调控，证实Notch2/hes-1信号通路是否参与肾IRI相关的炎症和氧化应激过程。
　　 3.观察冬虫夏草是否通过抑制Notch2/hes-1信号通路的活化，继而影响IL-6、TNF-α、MCP-1和HIF-1α的表达，通过抗炎和抗氧化发挥肾保护作用，从而探讨冬虫夏草的作用机制和靶点。
　　 实验方法：
　　 1.60只健康雄性SD(Sprasue-Dawley)大鼠用10％水合氯醛溶液(3.5mL/kg)腹腔注射局部浸润麻醉后，从腹部正中切口，行右肾切除术，稳定10min后将大鼠随机分成假手术组(sham组)、缺血-再灌注组(I/R)、DAPT组(DAPT)、冬虫夏草(CS)组4组，每组组内再按再灌注时间分为24h、48h、72h3个时间点。缺血-再灌注组(I/R组)大鼠持续夹闭左肾蒂60min后恢复灌注，予以生理盐水(2 mL/d)灌胃；DAPT组大鼠持续夹闭左肾蒂60min后恢复灌注，术后予以γ-泌肽酶抑制剂DAPT(500μg/100g.d)灌胃；冬虫夏草(CS)组大鼠持续夹闭左肾蒂60min后恢复灌注后，予以冬虫夏草提取液(5g/kg.d)灌胃；假手术组(sham组)大鼠切除右肾后分离左输尿管，但不夹闭左肾蒂，术后予以生理盐水(2 mL/d)灌胃，分别在上述时间点处死大鼠，处死前收集尿液和血液。检测各组大鼠肾功能(BUN、Scr)情况；ELISA法检测各组大鼠TNF-α、IL-6水平；比色法检测各组大鼠尿NAG水平，HE染色观察各组大鼠肾脏病理，并半定量评分法观察各组大鼠肾小管间质损伤；RT-PCR法检测各组大鼠Notch2、hes-1 mRNA的表达；免疫激光共聚焦法和western blot法检测各组大鼠Notch2、hes-1、MCP-1、HIF-1α蛋白的表达。
　　 2.首先用MTT法观察不同浓度DAPT(0.1μmol/L，1μmol/L，10μmol/L，100μmol/L)和CS提取液(10mg/L，20mg/L，40mg/L，80mg/L)对NRK52E增殖的影响，确定DAPT工作液和CS工作液的浓度。
　　 3.将NRK-52E细胞置于低糖型完全DMEM培养基中培养，分为normal组、缺血-再灌注组(I/R组)、DAPT组和CS组4组。I/R诱导的NRK-52E细胞模型用下法建立：用不含血清的D-Hanks液+抗霉素A(10μmol/L)模拟缺血3h，恢复低糖型完全DMEM培养基模拟再灌注。normal组NRK-52E不作任何处理，正常条件培养：DAPT组NRK-52E造模前24h和再灌注时用含10μmol/L DAPT工作液处理，直至收集细胞，组内按再灌注时间分为24h、48h、72h3个时间点；CS组(n=15)：按上述方法造模，造模前24h预先用含40mg/L的CS工作液处理，再灌注时用CS工作液培养，直至收集细胞，组内按再灌注时间分为24h、48h、73h3个时间点。细胞免疫化学荧光法和Western blot法观察各组NRK-52E细胞Notch2、hes-1、MCP-1、HIF-1α蛋白的表达。
　　 实验结果：
　　 1.体内实验结果显示，肾I/R时大鼠体内血清BUN和Scr升高，尿中NAG排出增多，肾脏病理出现肾小管刷状缘丢失、小管上皮细胞变性坏死、部分小管扩张、管型形成，肾间质大量炎症细胞浸润等病变，提示肾I/R大鼠AKI模型建立成功。肾I/R时大鼠血清TNF-α、IL-6水平增高(P<0.01)；肾组织中Notch2、hes-1、MCP-1、HIF-1α的mRNA和/或蛋白表达上调(P<0.01)，并均于再灌注后24h达高峰。而DAPT干预能改善肾小管间质损伤，改善肾功能，降低血清TNF-α、IL-6水平(P<0.05或P<0.01)，下调Notch2、hes-1、NF-κB2、MCP-1mRNA和/或蛋白表达，上调HIF-1α蛋白表达(P<0.01)，提示DAPT可选择性地阻断肾小管上皮细胞Notch2/hes-1信号通路，调控IL-6、TNF-α、MCP-1、HIF-1α等转录，有效地控制肾IRI时所诱导的炎症和氧化应激过程，具有良好的肾保护作用。
　　 2.体内实验结果显示，CS干预后可改善I/R大鼠肾小管间质损伤，改善其肾功能，同时降低血清TNF-α、IL-6及尿NAG水平(P<0.01)，下调Notch2/hes-1、MCP-1mRNA和/或蛋白表达(P<0.01)，上调HIF-1α蛋白表达(P<0.01)，提示CS对I/R时的肾保护作用可能是通过抑制Notch信号通路活化，调控IL-6、TNF-α、MCP-1、HIF-1等基因转录而实现的。
　　 3.MTT结果显示，与对照组OD值相比较，浓度为0.1～10μmol/LDAPT组和浓度为10-40mg/L CS NRK52E的OD值差异无统计学意义(P>0.05)；溶度为100μmol/L的DAPT和80mg/L的CS均能显著抑制NRK-52E的增值(P<0.01)。因此，我们在下面的实验选择DAPT和CS的处理溶度为10μmol/L和40mg/L。
　　 结论：
　　 1.肾IRl时IL-6、TNF-α、MCP-1和HIF-1α表达上调，证实肾IRI存在炎症和氧化应激过程。
　　 2.肾IRI诱导肾小管上皮细胞Notch2/hes-1信号通路活化，活化的Notch2/hes-1信号通路能调控IL-6、TNF-α、MCP-1和HIF-1α等的转录。
　　 3.冬虫夏草能减轻肾IRI时肾脏病理损伤，改善肾功能，有效抑制Notch2/hes-1信号通路的活化，下调IL-6、TNF-α、MCP-1等炎症因子的转录，上调肾小管上皮细胞HIF-1α的表达，证实冬虫夏草提取液通过影响Notch/hes-1信号通路而有效地抗炎、抗氧化作用，这可能是冬虫夏草新的肾保护作用机制。