转录因子Klf4对小鼠Dppa2基因调控作用的初步研究

摘要

第一部分1例新发成骨不全的突变鉴定及多态性筛查
　　 成骨不全( Osteogenesis imperfecta，OI)是一种结缔组织疾病，其特点是不同程度的骨质脆弱，常伴随身材矮小、蓝巩膜、听力丧失、牙本质发育不全、韧带及皮肤高度松弛等。成骨不全在全球范围内的发病率约为1/10，000-1/15.000。
　　 Ⅰ型胶原蛋白是机体纤维胶原的主要组成部分，占据了哺乳动物四分之一的体重。它主要存在于骨骼、骨膜、皮肤、韧带、血管、巩膜和角膜组织。若Ⅰ型胶原蛋白中的连续的三螺旋结构出现缺陷，则导致成骨不全。大多数成骨不全的病例是由于COL1A1或COL1A1基因发生突变所导致的，这两个基因分别编码Ⅰ型胶原蛋白的前α-1链和前a-2链。
　　 为了鉴定一家系中新发成骨不全病人的基因突变，我们应用PCR-DHPLC-DNA测序的基因诊断策略，发现在该病人COL1A1基因第36号外显子内存在一个杂合突变2461(2461 G＞A)，导致原来的甘氨酸突变为丝氨酸(G821S)。多态性筛查排除该突变为多态的可能，因此，该突变很可能导致成骨不全。
　　 第二部分转录因子K1f4对小鼠Dppa2基因调控作用的
　　 初步研究
　　 Dppa2(Developmental Pluripotency-Associated gene2)是近几年发现的在多能性细胞及某些癌组织中特异性表达的基因，与胚胎干细胞(ESCs)的多能性维持和自我更新有关，其表达抑制引起ESCs的分化。K1f4在体细胞重编程为诱导性多能干细胞(iPS)的过程中发挥了重要作用，其在胚胎发育进程中的调控作用引起世人的广泛关注。先前的研究证明Dppa2可能作为Oct4的靶基因参与到ESCs多能性维持和自我更新的调控网络中来。本课题借助生物信息学分析以小鼠胚胎干细胞(mESCs)为材料，探索转录因子K1f4的表达变化对Dppa2表达的影响。
　　 通过生物信息学分析，发现在Dppa2基因启动子区存在4个K1f4的转录因子结合位点，推测Dppa2作为K1f4的靶基因参与ESCs不分化状态的维持和自我更新。
　　 我们首先以mESCs的cDNA为模板，利用PCR获得K1f4的开放阅读框(ORF)，并将其克隆入真核细胞表达载体pCMV-myc中去，经过PCR、DNA测序等鉴定构建成功。接着我们利用PLKO.1载体构建了针对小鼠K1f4基因的RNA干扰（RNAi）载体，同样经过测序证明构建成功。
　　 为了鉴定干扰效果，我们向人的293T细胞（不表达小鼠K1f4基因）中，分别单独转染pCMV-myc-K1f4质粒，以及共转过表达质粒和干扰质粒，并以未处理的293T细胞作为对照。通过RT-PCR、Realtime PCR、 Western Blot等检测发现：单独转染K1f4真核表达质粒的293T细胞中可以检测到K1f4的高表达，而两种质粒共转和未处理的293T细胞中几乎检测不到该基因的表达，可见K1f4的真核表达载体、以及针对小鼠K1f4基因的RNAi载体均可发挥作用。
　　 最后，我们利用mESCs为材料，分别将针对小鼠K1f4基因的过表达质粒和RNAi载体瞬时转染，并检测Dppa2的表达。发现抑制K1f4的表达后，Dppa2的表达出现相应的下调。本课题初步证实K1f4的表达变化对Dppa2的表达有影响。尚需通过Chip和EMSA等实验证实其在体内外的确存在结合。

目录

文摘

英文文摘

中英文缩略词

第一部分 1例新发成骨不全的突变鉴定及多态性筛查

前言

实验技术路线

1 研究对象与实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

5 结论

参考文献

第二部 分转录因子K1f4对小鼠Dppa2基因转录调控作用的初步研究

技术路线图

前言

第一章 材料与方法

第二章 实验结果

第三章 讨论

第四章 结论

参考文献

综述 DPPA2基因的研究进展

参考文献

致谢