水稻叶绿体表达载体的构建及遗传转化

摘要

叶绿体转化技术具有诸多优点,但是该技术在水稻上的应用较少。本实验中,分别克隆了水稻叶绿体表达载体的不同元件,以水稻总DNA为模板,PCR扩增了叶绿体基因组同源重组片段trnI和trnA,与GenBank中水稻叶绿体基因组比对,同源性分别达到99.93％和100％;以载体pEGFP-N2为模板,PCR扩增了具有3种含不同RBS序列的增强型绿色荧光蛋白基因(egfp);烟草叶绿体启动子Prrn和终止子TpsbA克隆自载体pLM21,与GenBank中烟草叶绿体基因组比对,同源性分别达到97.35％和100％。构建了3种能编码增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的水稻叶绿体转化载体pIA-EGFP1、pIA-EGFP2和pIA-EGFP3并进行了酶切检测。将上述所构建载体电转入大肠杆菌,观察了大肠杆菌内egfp的表达情况,结果显示,携带的RBS来源于(λ)噬菌体T7gene10的5'UTR的载体pIA-EGFP3荧光最强。以载体pCAMBIA1301为模板,PCR扩增了RBS为T7gene10的5'UTR的潮霉素磷酸转移酶基因(hpt),并将该片段连入了载体pIA-EGFP3,构建了载体pIA-EGFP3-HPT,将载体电转入大肠杆菌后检测了潮霉素抗性,转化成功的大肠杆菌具有潮霉素抗性。将载体pIA-EGFP3-HPT通过基因枪轰击洋葱表皮细胞,观察egfp的瞬时表达,结果在洋葱表皮细胞中观测到了明显的绿色荧光,说明载体pIA-EGFP3-HPT在洋葱质体中成功表达,因此认为载体pIA-EGFP3-HPT适合用于水稻叶绿体转化,目前烟草的转叶绿体技术比较成熟,且扩增得到的同源片段与叶绿体基因组有较高的同源性,因此将载体轰击烟草叶片。

目录

文摘

英文文摘

第一章 绪论

1.1 叶绿体基因组

1.2 叶绿体转化的发展历程

1.3 叶绿体遗传转化的优点

1.3.1 母性遗传

1.3.2 表达量高

1.3.3 定点表达

1.3.4 多顺反子表达

1.4 叶绿体表达载体

1.4.1 同源片段

1.4.2 叶绿体启动子和终止子

1.4.3 叶绿体遗传转化筛选标记

1.4.4 转入叶绿体的外源基因

1.5 外源基因导入叶绿体

1.6 叶绿体基因组的同质化

1.6 研究的目的与意义

第二章 研究内容及技术路线

第三章 实验材料

3.1 植物、菌株和载体

3.2 试剂与试剂盒

3.3 生物信息学分析软件

3.4 实验所用引物

3.4.1 同源片段trnI和trnA引物

3.4.2 增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)的引物

3.4.3 烟草叶绿体启动子和终止子引物的设计

3.4.4 潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)引物的设计

第四章 实验方法

4.1 水稻总DNA的提取

4.2 大肠杆菌DH10B感受念的制备

4.3 水稻叶绿体同源片段trnI和trnA扩增和克隆

4.4 增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)的扩增和克隆

4.5 烟草叶绿体启动子和终止子的扩增与克隆

4.6 潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)的扩增与克隆

4.7 水稻叶绿体表达载体的构建

4.7.1 含egfp基因的水稻叶绿体表达载体的构建

4.7.2 含egfp和hpt的水稻叶绿体表达载体的构建

4.8.1 载体pIA-EGFP3-HPT的大量抽提

4.8.2 载体pIA-EGFP3-HPT基因枪轰击洋葱表皮细胞

4.9 载体pIA-EGFP3-HPT转化水稻愈伤组织

4.9.1 水稻胚性愈伤组织的诱导

4.9.2 愈伤组织的预培养

4.9.3 基因枪转化水稻愈伤组织

4.9.4 抗性愈伤的筛选

4.10 载体pIA-EGFP3-HPT转化烟草叶片

4.10.1 烟草无菌苗的获得

4.10.2 烟草叶片的预处理

4.10.3 基因枪转化烟草叶片

4.10.4 抗性愈伤的筛选

第五章 结果与分析

5.1 水稻叶绿体同源片段trnI和trnA扩增和克隆

5.1.1 扩增PCR扩增的同源片段trnI和trnA的电泳检测

5.1.2 同源片段trnI和trnA克隆的测序分析

5.2 PCR扩增的egfp片段的电泳检测

5.4 烟草叶绿体启动子Prrn和终止子TpsbA的扩增与克隆

5.4.1 PCR扩增的Prrn片段和TpsbA片段的电泳检测

5.4.2 Prrn片段和TpsbA片段的测序分析

5.5 PCR扩增的hpt片段的电泳检测

5.6 构建的水稻叶绿体表达载体的检测

5.6.1 含egfp的水稻叶绿体转化载体的酶切验证

5.6.2 基因枪转化的大肠杆菌的荧光观察

5.6.3 水稻叶绿体转化载体pIA-EGFP3-HPT的潮霉素抗性检测

5.7 载体pIA-EGFP3-HPT在洋葱表皮细胞中的瞬时表达

5.8 水稻抗性愈伤的筛选

5.9 烟草抗性愈伤的筛选

第六章 讨论

6.1 同源片段的选择

6.2 外源基因的表达

6.2.1 egfp的表达

6.2.2 hpt作为筛选标记

6.3 外源基因的烟草叶绿体中的稳定整合

6.4 水稻叶绿体转化技术

6.4 水稻叶绿体转化技术的展望

参考文献

附录1 仪器设备

附录2 试剂配方

附录3 缩略词

致谢

作者在学期间取得的学术成果