高效液相色谱-荧光法同时测定慢性肾功能不全患者血清中芳香族氨基酸

摘要

目的：
　　 1.建立一种高效液相色谱-荧光法(HPLC-FLD)同时测定健康成人血清中芳香族氨基酸(AAA)即苯丙氨酸(PHE)、酪氨酸(TYR)和色氨酸(TRP)含量。
　　 2.初步探讨慢性肾功能不全(CRI)患者血清中AAA含量测定的临床意义。
　　 方法：
　　 1.血清标本去蛋白后，离心取20μL上清液直接进样测定，采用Megres C18色谱柱(4.6mm×250mm i.d.，5μm)分离，流动相为乙腈：水(10:90，V/V)，流速为1.0 ml/min，通过对TYR、PHE和TRP激发光波谱(范围200～450nm)和发射光波谱(250～500nm)扫描，得到各自的最适激发光波长和最适发射光波长；TYR、PHE和TRP峰采用峰保留值和峰叠加法定性分析；用外标法测定峰面积进行定量分析。同时探讨了检测波长、流速、PH值和流动相中有机相的比例等因素对分离度和灵敏度的影响，考察了其它物质是否对待测组分的检测存在干扰，并且通过对线性范围、检测限、精密度、回收率和干扰试验的考察，对该方法进行方法学评价。
　　 2.测定健康成人(n=100例)血清PHE、TYR和TRP含量，并计算AAA总量及TYR/PHE比值。
　　 3.测定CRI患者(n=80例)血清PHE、TYR和TRP含量，计算AAA总量及TYR/PHE比值，并用ROC曲线评价其诊断CRI的敏感度、特异度和方法学效能；CRI患者血清AAA总量、PHE、TYR及TRP含量与血清中其他相关生化指标进行简单线性相关性分析；并探讨AAA总量、PHE、TYR和TRP含量及TYR/PHE比值变化在CRI分期分型、病理生理、治疗监测等方面的临床意义。
　　 结果：
　　 1.标准品和血清样本的TYR、PHE和TRP峰三者分离良好(分离度(R)>1.5)，TYR保留时间约为4.3min，线性方程为Y=12443.8+58345X，R=0.998，线性范围为0.55～275.00μmol/L，最低检测限为0.014μmol/L，回收率为98.0％～103.0％，日内和日间RSD分别为3.92％和4.20％；PHE保留时间约为5.8min，Y=6578.32X+202946.74，R=0.997，线性范围为3.05～1220.0μ mol/L，最低检测限为0.51μmol/L，回收率为97.8％～104.2％，日内和日间RSD分别为3.14％和3.37％；TRP保留时间为9.5min，Y=260440.86X-11828.17，R=0.999，线性范围为0.049～49μmol/L，最低检测限为0.0049μmol/L，回收率为97.3％～103.5％，日内和日间RSD分别为2.32％和3.18％；5-羟色胺、犬尿氨酸和犬尿喹啉酸等物质对本方法无干扰；三者的峰面积与进样浓度线性关系良好。
　　 2.100例健康成人血清PHE的浓度平均为(66.72±11.57)μmol/L；TYR浓度平均为(63.53±4.68)μmol/L；TRP浓度平均为(44.22±3.67)μmol/L；AAA总浓度平均为(174.47±11.57)μmol/L；TYR/PHE比值平均为(0.95±0.40)。
　　 3.80例CRI患者PHE的浓度平均为(61.98±12.38)μmol/L；TYR浓度平均为(52.27±8.25)μmol/L；TRP浓度平均为(21.49±4.25)μmol/L，AAA总浓度平均为(135.74±12.23)μmol/L；TYR/PHE比值平均为(0.84±0.67)。与正常对照组比较，CRI患者组血清AAA总量、TYR、TRP含量及TYR/PHE比值均显著下降，差异均有统计学意义(AAA、TYR和TRP的t值分别为5.095、3.423和-15.774，TYR/PHE的U值为247.000，P值均<0.05)，PHE含量轻微下降，差异无统计学意义(t=0.17，P>0.05)。CRI患者不同分期TYR、PHE和TRP含量比较，差异无统计学意义(P值均>0.05)；慢性肾炎型、糖尿病型和高血压型三种类型CRI患者的TYR、PHE和TRP含量比较，其中TYR在慢性肾炎组、高血压组和糖尿病组间比较，差异无统计学意义；PHE在慢性肾炎组与糖尿病组之间比较差异有统计学意义(U=408.00，P=0.030)；TRP在慢性肾炎组与糖尿病组、慢性肾炎组与高血压组之间比较差异有统计学意义(分别U=327.00，P=0.002；U=99.00，P=0.033)。CRI患者血清PHE与UREA、UA有一定相关性(P<0.05)；TRP与UA、AAA与UA、TP与TRP分别具有一定的相关性(P均<0.05)。血清AAA总量诊断CRI的ROC曲线的AUC为0.962，当以<157.43μmol/L为临界值时，其敏感度和特异度分别为88.9％和100.0％。
　　 结论：
　　 1.本文建立了一种能够同时测定PHE、TYR和TRP的HPLC-FLD法，并运用该方法测定100例健康成人血清PHE、TYR和TRP含量，方法简便、快速、灵敏，适于临床和科研应用。
　　 2.初步探讨了血清中AAA、PHE、TYR、TRP含量及TYR/PHE比值在CRI中的临床意义，测定血清中AAA含量对CRI的诊断、分期以及病因研究有一定的应用价值。