活性氧在博莱霉素促成纤维细胞增殖和胶原合成分泌中的作用

摘要

特发性肺纤维化是临床上常见的进行性的、致死性的肺疾病，以肺成纤维细胞过度增生和细胞外基质沉积为特点，发病机制不清。因博莱霉素(bleomycin，BLM)诱导的肺纤维化病理过程与人类特发性肺纤维化极其相似，故其已成为制备肺纤维化模型的常用药物。BLM可通过促Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡、促血小板聚集并活化，以及促巨噬细胞分泌大量细胞因子等途径促进肺纤维化发生发展。然而在致纤维化过程中，BLM对肺纤维化的关键细胞-成纤维细胞的直接作用并不确定。BLM是否可通过对成纤维细胞的直接作用引起肺纤维化，仍存在很大的争议。活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)是超氧阴离子(O2-)、一氧化氮(NO)、羟自由基(OH-)、过氧化氢(H2O2)等含氧化合物的总称。ROS能够引起DNA断裂，脂质过氧化以及碳水化合物氧化。并且已知ROS与肝纤维化、动脉粥样硬化以及腹膜纤维化等多种纤维化疾病发生有关。而BLM能够通过直接攻击DNA等方式损伤细胞，进而造成纤维化。BLM引起的DNA链断裂经由ROS介导，并且这种作用能被超氧化物歧化酶减弱。那么，ROS是否也是BLM致肺纤维化的机制之一呢？对此，国内外相关研究较少。更多的分子机制暗示，ROS通过作用于受体激酶、转录因子、DNA分子等多种途径在体内发挥作用。低氧诱导因子（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）是一种转录因子，是ROS的靶标之一。ROS能通过HIF-1参与体内多种活动调节，但二者在BLM致肺纤维化中的联系尚不清楚。
　　 目的：利用BLM直接作用于小鼠成纤维细胞，观察该药物对成纤维细胞增殖及胶原合成的影响，并在此基础上进一步利用能清除细胞内ROS的试剂锰苯甲酸卟啉[Mn(Ⅲ) tetrakis(4-benzoic acid)porphyrin，MnTBAP]清除ROS，来观察ROS在BLM致成纤维细胞增殖及胶原合成过程中的作用。同时，探讨了HIF-1在BLM作用中的变化，为阐明ROS是否通过HIF-1起作用铺路。
　　 方法：采用MTT法和流式细胞术测定体外培养的小鼠成纤维细胞对BLM的增殖反应。同时，天狼星红染色和Real-time PCR分别从蛋白水平和基因表达水平检测小鼠成纤维细胞胶原蛋白的表达和分泌的变化。此外，还采用RT-PCR检测HIF-1 mRNA相对水平的变化。
　　 结果：⑴MTT结果显示:BLM组MTT所测OD值较对照组呈剂量依赖性和时间依赖性显著增高(p＜0.05或p＜0.01)。⑵流式细胞术结果显示:选用增殖指数(PrI)作为指标，BLM组处于增殖期的细胞百分比明显较对照组高(p＜0.05)。⑶天狼星红染色结果显示:BLM作用于小鼠成纤维细胞，可以引起小鼠成纤维细胞胶原合成增加(p＜0.05)。但这种作用随着BLM剂量的增加而下降，给药组间差异明显(p＜0.01)。⑷Real-time PCR检测结果显示:BLM组细胞Ⅲ型前胶原蛋白mRNA相对表达水平明显高于对照组(p＜0.05)。⑸流式细胞术结果显示:阻断ROS后，BLM+MnTBAP组处于增殖期的细胞百分数较BLM组明显降低(p＜0.05)。⑹天狼星红结果显示:MnTBAP+BLM组较BLM组胶原含量显著下降（其中BLM1μg/L组p＜0.01;BLM3μg/L组p＜0.05）。⑺Real-time PCR检测结果显示:BLM+MnTBAP组Ⅲ型前胶原mRNA相对表达较BLM组显著下调(p＜0.05)。⑻BLM诱导小鼠成纤维细胞HIF-1 mRNA相对表达水平变化与空白对照组相比，BLM使得HIF-1 mRNA相对表达水平显著升高(p＜0.01)。
　　 结论：①BLM可直接促进小鼠成纤维细胞的增殖及胶原合成，但胶原合成随细胞增殖增强有下降趋势。②ROS介导BLM引起的小鼠成纤维细胞增殖及BLM引起的胶原合成增加。③BLM可上调小鼠成纤维细胞HIF-1 mRNA的表达，提示HIF-1可能介导BLM对成纤维细胞的影响过程。

目录

声明

论文说明

摘要

英文缩写注解

前言

第一章 材料与方法

1．实验材料

2．方法

3．统计学分析

第二章 结果

1．BLM对小鼠成纤维细胞的作用

2．ROS在介导BLM促成纤维细胞增殖及胶原合成分泌中的作用

3．RT-PCR检测BLM对小鼠成纤维细胞HIF-1 mRNA表达的影响

4．附图

第三章 讨论

第四章 结论

参考文献

综述

致谢

攻读硕士期间主要研究成果