癫痫大鼠海马miRNAs表达谱和miR-34a与-9在癫痫发生中动态变化的研究

摘要

第一部分癫痫大鼠海马miRNA表达谱、实时荧光定量PCR验证差异表达miRNAs、生物信息学分析差异表达miRNAs
　　 目的:
　　 通过应用miRNA微阵列芯片技术，检测和分析颞叶癫痫大鼠海马脑组织miRNA表达谱，筛选具有差异表达的miRNAs;通过荧光定量PCR技术验证具有差异表达的miRNAs，针对具有差异表达的miRNAs，检测其在外周血的表达、与脑组织的表达进行对比;运用生物信息学方法，预测差异表达miRNAs的靶基因、基因聚类项目、以及生物学通路，为探讨在颞叶癫痫状态下miRNAs对中枢神经系统的损伤机制奠定基础。
　　 方法:
　　 1.颞叶癫痫大鼠动物模型:通过氯化锂-匹罗卡品致痫、以及随后视频观察、脑电图监测，建立颞叶癫痫大鼠动物模型。
　　 2.miRNA微阵列芯片检测、筛选差异表达miRNAs:提取癫痫大鼠脑组织海马区miRNAs，采用miRNA微阵列芯片技术，检测和分析颞叶癫痫大鼠海马区脑组织的miRNA表达谱。
　　 3.实时荧光定量PCR验证具有差异表达miRNAs:选取miRNA芯片检测具有显著差异表达的miRNAs，采用实时荧光定量PCR技术，验证其在海马区脑组织中的表达，并对上述miRNAs在大鼠外周血中的表达进行检测，对比脑组织和外周血中miRNAs的表达差异。
　　 4.通过生物信息学分析，预测靶基因、分析基因聚类、预测富集生物学通路:利用TargetScan预测差异表达miRNAs的靶基因;针对差异表达miRNAs的靶基因进行基因聚类分析;应用KEGG数据库预测可能富集的生物学信号通路。
　　 结果:
　　 1.癫痫大鼠海马区脑组织中差异表达的miRNAs:应用miRNA微阵列芯片技术，在癫痫大鼠海马区脑组织中检测到上调miRNAs基因9个，下调miRNAs基因15个。
　　 2.实时荧光定量PCR验证具有差异表达的miRNAs:选择具有上调改变的3个miRNA基因(miR-146a、miR-210、miR-27a)和具有下调改变的2个miRNA基因（miR-135b、miR-33），实时荧光定量PCR结果显示:miR-146a、miR-210、miR-27a表达上调，miR-135b、miR-33表达下调，与芯片结果相一致;但上述miRNAs在外周血中并不具有显著的差异表达，不能达到替代海马区脑组织中具有显著差异表达miRNAs的作用。
　　 3.通过应用生物信息学分析miRNA芯片检测、具有差异表达的miRNAs:通过TargetScan靶基因预测软件，得到了差异表达miRNAs的靶基因;利用基因聚类(Gene Ontology)对靶基因进行了分析，得到具有显著统计学意义的基因聚类项目;应用KEGG数据库对靶基因进行分析，得到了具有显著统计学意义、可能富集的生物学信号通路。
　　 结论:
　　 1.建立了颞叶癫痫大鼠动物模型，获得了颞叶癫痫大鼠海马区脑组织中的miRNA表达谱。
　　 2.通过芯片检测得到了颞叶癫痫状态下海马区脑组织中可能具有差异表达的24个miRNA靶基因，其中9个miRNA靶基因具有上调改变、15个miRNA靶基因具有下调改变。
　　 3.验证了具有差异表达的miRNA靶基因:miR-146a、miR-210、miR-27a、miR-135b、miR-33;但未发现上述miRNA靶基因在癫痫大鼠外周血中具有差异表达、以及与海马区脑组织中miRNAs的变化呈现相关性。
　　 4.生物信息学分析得到了差异表达miRNAs所指向的靶基因、基因聚类、以及生物学富集信号通路，这些靶基因、基因聚类和生物学信号通路都被认为与慢性癫痫状态以及癫痫形成过程有关。
　　 第二部分大鼠海马miR-34a与miR-9在癫痫发生中动态变化的研究
　　 目的:
　　 建立氯化锂-皮罗卡品癫痫大鼠模型，选取癫痫形成过程中的重要时点，应用荧光定量PCR技术，对凋亡相关的miR-34a与神经再生相关的miR-9的表达进行检测，通过比较各时间点miR-34a、miR-9的表达水平，研究上述两种miRNAs在癫痫形成过程中的表达改变，为深入阐明神经元凋亡和再生相关的miRNAs在癫痫发病机制中的作用奠定基础。
　　 方法:
　　 1.癫痫大鼠动物模型:通过氯化锂-匹罗卡品致痫、以及随后视频观察、脑电图监测，建立癫痫大鼠动物模型。并在成功建模后，选取癫痫持续状态后1天、7天、14天、以及2个月（颞叶癫痫大鼠）为主要研究时点。
　　 2.提取各研究时点中大鼠海马区脑组织中的RNA，应用实时荧光定量PCR技术，对大鼠海马区脑组织中miR-34a和miR-9的表达水平进行检测和分析，将各研究时点上述两种miRNAs的表达水平进行比较，通过统计学分析其在各研究时点上的表达水平差异。
　　 结果:
　　 1.建立了癫痫大鼠动物模型，得到了癫痫形成各时间点上的大鼠海马区脑组织标本。
　　 2.应用实时荧光定量PCR技术，对各研究时点上miR-34a、miR-9的表达水平进行了检测、分析和统计学差异比较，结果表明miR-34a在癫痫持续状态后1天、7天、14天、2月（慢性癫痫状态）均呈现表达升高改变，在癫痫持续状态后14天达到高峰，在癫痫持续状态后2月（慢性癫痫状态）表达水平已经回落、但仍较正常对照组升高;miR-9在癫痫持续状态后1天、7天、14天均呈现表达升高改变，在癫痫持续状态后14天达到高峰，在癫痫持续状态后2月（慢性癫痫状态）表达水平已明显回落、与正常对照组不具有明显差异。
　　 结论:
　　 凋亡相关miR-34a、神经再生相关miR-9在癫痫形成过程中呈现表达的动态改变，提示上述miRNAs可能参与了癫痫的发病机制，值得今后深入研究和探讨。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

第一部分 癫痫大鼠海马miRNA表达谱、实时荧光定量PCR验证差异表达miRNAs、生物信息学分析差异表达miRNAs

第一章 癫痫大鼠海马miRNA表达谱

1．前言

2．材料和方法

3．结果

4．讨论

5．结论

第二章 实时荧光定量PCR验证差异表达miRNAs

1．前言

2．材料和方法

3．结果

4．讨论

5．结论

第三章 生物信息学分析差异表达miRNAs

1．前言

2．实验方法

3．结果

4．讨论

5．结论

第二部分 大鼠海马miR-34a、miR-9在癫痫发生中动态变化的研究

1．前言

2．材料和方法

2．1 主要仪器和试剂

2．2 实验动物分组和标本制备

2．3 试剂制备

2．4 实验步骤

3．结果

3．1 动物行为学观察

3．2 qPCR检测miR-34a与miR-9在癫痫形成中的表达改变

4．讨论

4．1 miRNAs与细胞凋亡

4．2 miRNAs与海马神经再生

4．3 miR-34a与miR-9在癫痫形成中表达的动态变化

5．结论

参考文献

综述

致谢

攻读博士学位期间主要研究成果