沉默Notch-1受体增强前列腺癌PC-3细胞对多西他赛药物敏感性的机制研究

摘要

前列腺癌是欧美老年男性常见的恶性肿瘤，发病率长期位居第一位，在我国其发病率也逐年上升。内分泌治疗是目前前列腺癌主要的治疗方法，大多数患者起初对其敏感，但经过18～24个月后，几乎所有的患者发展为对激素不敏感，最后转归成为去势难治性型前列腺癌(Castrate-resistant prostate cancer, CRPC)。CRPC的治疗是以多西他赛(Docetaxel)为主的化学治疗。多西他赛是半合成紫杉醇的衍生物，它可通过加强微管蛋白聚合作用和抑制微管解聚作用，使细胞形成稳定的非功能性微管束，因而破坏肿瘤细胞的有丝分裂，并阻滞细胞于G2/M期，最终导致肿瘤细胞凋亡。同时，多西他赛可以诱导肿瘤细胞中抑制凋亡的基因Bcl-2磷酸化，多西他赛还可以提高游离Bax蛋白水平，最终促进细胞凋亡。多西他赛是被FDA批准用于治疗CRPC的首个药物，以其为主的抗肿瘤药物联合治疗是目前CRPC治疗标准方案。
　　 尽管多西他赛疗效显著，但其在中位6.3个月后常产生耐药性，严重影响化疗效果。目前，对于这类药物的耐药研究主要集中在紫杉醇耐药，许多学者对肺癌、卵巢癌细胞的耐药机制进行了深入的分析。研究发现，α和β微管蛋白的过度表达、微管蛋白的突变和微管蛋白翻译后的修饰可以拮抗紫杉醇的微管稳定作用，减少肿瘤细胞对紫杉醇的敏感性，并能对抗紫杉醇诱导的聚合，降低微管聚合率，从而导致耐药。同时，耐药基因TRAG-3和P-糖蛋白表达升高可能也是导致紫杉醇耐药的重要原因。另外凋亡基因或促凋亡基因的表达异常也是细胞发生耐药的重要原因。
　　 Notch是一种在进化上十分保守的跨膜受体蛋自家族，其主要功能是参与多细胞生物胚胎期和出生后早期的生长与发育过程。Notch信号途径的精确调控，对大多数组织的正常发育至关重要;其异常凋控引起组织发育异常，并导致肿瘤等多种疾病的发生。已有多个研究显示抑制Notch-1表达后肿瘤细胞凋亡增加，增殖和侵袭能力被抑制。多西他赛的抗肿瘤效果即体现在其通过对多个信号通路的调控影响肿瘤细胞的增殖和凋亡，其与Notch信号通路是否存在交叉传导，目前为止未见文献报道。如果抑制Notch通路能够增加多西他赛抗肿瘤的效果，此即可能成为前列腺癌治疗的有效靶点。
　　 第一章Notch-1 siRNA的筛选及沉默Notch-1对PC-3细胞生物学行为的影响
　　 目的:合成并筛选有效的Notch-1 siRNA序列转染至PC-3细胞，了解沉默Notch-1对PC-3细胞生物学行为的影响。
　　 方法:采用化学转染法将针对Notch-1特异性序列的3对不同siRNA转染至PC-3细胞，real time RT-PCR和Western Blot检测Notch-1 mRNA和蛋白的表达筛选出沉默效率最高的序列。将筛选的序列转入PC-3细胞后行MTT检测了解细胞增殖情况，采用流式细胞术检测细胞凋亡情况和行细胞周期分析，应用Transwell小室法检测肿瘤细胞侵袭能力。
　　 结果:Notch-1 siRNA-6150的沉默效果最好，可用于后续实验。转染Notch-1 siRNA48 h后，PC-3细胞存活率由(98.50±0.99)％下降至(90.60±2.11)％(P＜0.05)，细胞凋亡率升高3.3倍(P＜0.05)，S期细胞比例由26.4％上升至41.4％(P＜0.05)，侵袭至Transwell小室滤膜下表面的PC-3细胞数由214.90±16.81个下降至136.56±9.94个(P＜0.05)。
　　 结论:沉默Notch-1受体不仅可抑制PC-3细胞生长并促进凋亡，将细胞周期阻滞于S期，并且沉默Notch-1受体可降低PC-3细胞的侵袭能力。
　　 第二章沉默Notch-1基因协同多西他赛对PC-3细胞增殖与凋亡的影响及机制初探
　　 目的:了解沉默Notch-1受体能否增强多西他赛诱导凋亡及抑制增殖的作用，并了解凋亡相关因子Bcl-2家族成员Bcl-2和Bax表达的变化。
　　 方法:使用MTT法检测不同浓度多西他赛作用于PC-3细胞不同时间发生细胞凋亡的情况。转染siRNA进入前列腺癌PC-3细胞沉默Notch-1受体并加入IC30多西他赛继续作用，采用MTT检测PC-3细胞增殖能力，流式细胞术检测细胞凋亡，real time RT-PCR检测Bcl-2和Bax mRNA的相对表达量，Westem Blot检测Bcl-2和Bax蛋白的表达。
　　 结果:经过筛选，获得50 ng/mL(60 nM)多西他赛浓度作用24h的实验条件用于后续实验。MTT测得转染siRNA和多西他赛分别作用后干扰组的细胞存活率为(90.60±2.11)％，多西他赛组为(79.30±2.59)％。但联合组细胞存活率下降更为明显，为(64.50±2.25)％（P＜0.05）。流式细胞术检测发现联合作用后的细胞凋亡率为(17.16±0.61)％，较单纯使用多西他赛((5.39±0.22)％)增加了3.2倍（P＜0.5）。干扰组和多西他赛组中Bcl-2的mRNA和蛋白表达均明显下调（P＜0.5），而Bax的mRNA和蛋白表达均明显上调(P＜0.5)。更进一步发现较干扰组和多西他赛组，联合组的Bcl-2的mRNA和蛋白表达均明显下调(P＜0.5)，而Bax的mRNA和蛋白表达均明显上调（P＜0.5）。
　　 结论:通过沉默Notch-1调控Bcl-2家族成员的表达，即抗凋亡因子Bcl-2表达下调和促凋亡因子Bax的表达上调，能够增加多西他赛对PC-3细胞的敏感性。
　　 第三章沉默Notch-1基因协同多西他赛对PC-3细胞周期的影响及机制初探
　　 目的:了解沉默Notch-1受体能否增强PC-3细胞中多西他赛诱导细胞周期阻滞的作用，并了解细胞周期调控因子p21 waf1/cip1和Akt表达的变化。
　　 方法:转染siRNA进入前列腺癌PC-3细胞沉默Notch-1受体并加入不同浓度多西他赛继续作用，采用MTT检测PC-3细胞增殖能力。沉默Notch-1受体并加入IC30多西他赛继续作用，使用流式细胞术检测细胞周期、real time RT-PCR检测p21waf1/cip1和Akt mRNA的相对表达量，Western Blot检测p21waf1/cip1和Akt蛋白的表达。结果:干扰组IC50由264.57±3.12 nM降至149.91±2.80 nM(P＜0.5)。我们发现在PC-3细胞中使用IC30剂量的多西他赛24 h后位于G2/M期的细胞比例由29.1％升至38.7％(P＜0.05)。联合作用较单独使用多西他赛其位于G2/M期的细胞比率明显增加，由38.7％升至53.0％(P＜0.05)。联合组的p21waf1/cip1的mRNA和蛋白表达量明显高于干扰组和多西他赛组，而Akt及p-Akt的表达水平明显下调(P＜0.05)。
　　 结论:进一步证明沉默Notch-1明显增强多西他赛的药物敏感性;这一特性与沉默Notch-1诱导细胞周期阻滞有关，其上调p21waf1/cip1和下调Akt的作用可能参与其中。

目录

声明

摘要

英文缩略词

前言

第一章 Notch-1 siRNA的筛选及沉默Notch-1对PC-3细胞生物学行为的影响

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．3 结果

1．4 讨论

1．5 小结

第二章 沉默Notch-1基因协同多西他赛对PC-3细胞增殖与凋亡的影响及机制初探

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 结果

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 沉默Notch-1基因协同多西他赛对PC-3细胞周期的影响及机制初探

3．1 实验材料

3．2 实验方法

3．3 结果

3．4 讨论

3．5 小结

结论

参考文献

综述

致谢

读书期间发表的论文及有关成果