曲古抑菌素A对伊马替尼耐药慢性粒细胞白血病细胞的研究

摘要

研究背景
　　伊马替尼是针对慢性粒细胞白血病特异性的癌基因BCR/ABL的靶向治疗药物,它能阻断酪氨酸激酶的自身磷酸化和底物磷酸化,在临床取得了非常好的疗效,患者能够达到分子学的缓解。但是随着临床使用伊马替尼的时间延长和受试人群的增多,伊马替尼的耐药不可避免地出现了,其原发和继发耐药率达25％以上。其复杂的耐药机制迫使我们寻找新的药物。
　　表观遗传学是研究不改变DNA序列而通过DNA外部修饰调节基因表达的学科,其主要内容有DNA甲基化、组蛋白修饰、基因印记、RNA干扰等。近年来的研究显示,表观遗传学的改变与肿瘤有密切关系,通过表观遗传学的调控能够抑制肿瘤,基于这种理念产生了一批新的药物,其中组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylaseinhibitors,HDACIs)是研究热点。
　　目前研究已经证实组蛋白去乙酰化酶抑制剂对伊马替尼耐药的细胞株有抑制作用,与伊马替尼合用作用更强,但是它在抑制细胞增殖过程中对特定基因的调控尚不清楚,这种调控是否涉及DNA甲基化也不明确。而且由于表观遗传学的调控的不可控性,在HDACIs抑制肿瘤细胞的同时诱导了包括ABCG2在内大量药物转运蛋白的表达,并且有可能导致新的交叉耐药,这个为HDACIs的临床运用设置了障碍,HDACIs对药物转运蛋白的调控机制如何?如何看待和减少它的不良反应?这些也有待进一步的研究。这些将丰富我们关于HDACIs类药物的全面认识,对HDACIs未来的使用提供指导。本研究选用曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA),一种氧肟类的组蛋白去乙酰化酶抑制剂对伊马替尼耐药的细胞株的作用及机制的探讨,分为以下三部分
　　第一章:曲古抑菌素A单用及联用伊马替尼对K562R细胞增殖和凋亡的研究
　　目的:探讨曲古抑菌素A对耐伊马替尼慢性粒细胞白血病细胞株K562R的增殖凋亡的影响。
　　方法:采用3-(4,5-二甲基-2-基)-5(3-羧基甲基苯基)-2-(4-磺酸苯基)-2H-四氮唑细胞毒试验法观察细胞增殖抑制,细胞凋亡率采用流式细胞仪凋亡试剂盒检测。
　　结果::IM对K562的IC50为0.58±0.21μmol/L,对K562R的IC50为23.88±3.45μmol/L,K562R的耐药倍数约为41.5。不同浓度的TSA单用能抑制K562R的增殖,并且随浓度增大和时间延长抑制作用越强。不同浓度TSA与IM联用比单用TSA抑制作用更强,具有明显协同作用,并且随TSA浓度加大和时间延长协同作用越强。对照组,单用伊马替尼组,TSA组和TSA联用伊马替尼组24h检测的凋亡率分别为(2.5±1.3)％,(4.7±1.2)％,(12.0±1.8)％,(22.1±3.5)％。单用TSA较伊马替尼组凋亡率明显增加,联用组较单用TSA凋亡率明显增加。
　　结论:TSA能抑制K562R细胞的增殖,诱导K562R细胞凋亡,与伊马替尼联用有明显协同作用。TSA可能为临床伊马替尼耐药的患者提供新的治疗药物。
　　第二章:曲古抑菌素A对K562R细胞BCR/ABL基因的影响和表观遗传学调控研究
　　目的:探讨TSA对BCR/ABL基因的表达的影响和BCR/ABL基因启动子区表观遗传学修饰。
　　方法:采用实时荧光定量PCR检测mRNA的表达,Western blot检测蛋白表达,染色质免疫共沉淀方法检测BCR/ABL基因启动子区AcH3、AcH4的水平,甲基化特异性PCR检测BCR/ABL基因启动子区CpG岛甲基化状态。
　　结果:与K562细胞比较,K562R细胞BCR/ABL的mRNA和蛋白表达水平均上调,K562R细胞总的AcH3、AcH4的水平,BCR/ABL基因启动子区AcH3、AcH4的水平,CpG岛甲基化状态均没有明显改变。TSA能下调K562R细胞BCR/ABL的mRNA和蛋白表达水平,与伊马替尼合用作用更明显。TSA诱导后细胞内总的AcH3、AcH4的水平上调,BCR/ABL启动子区AcH3、AcH4的水平无明显变化,其启动子区CpG岛甲基化状态没有改变。
　　结论:TSA联用伊马替尼能明显下调BCR/ABLmRNA和蛋白表达,为伊马替尼耐药患者提供了新的选择。TSA对BCR/ABL启动子区组蛋白乙酰化水平和CpG岛甲基化状态没有明显改变,它对BCR/ABL的调控有待进一步的研究。
　　第三章:曲古抑菌素A对ABCG2基因表达的影响以及表观遗传学的调控
　　目的:探讨TSA对ABCG2基因表达的影响和调控机制,干预ABCG2对TSA细胞增殖抑制作用的影响。
　　方法:采用实时荧光定量PCR检测mRNA的表达,Western blot检测蛋白表达,染色质免疫共沉淀方法检测ABCG2基因启动子区AcH3、AcH4的水平,甲基化特异性PCR检测ABCG2基因启动子区CpG岛甲基化状态,MTS法观察细胞增殖抑制。
　　结果:与K562细胞比较,K562R细胞ABCG2的mRNA和蛋白表达水平均上调,K562R细胞总的AcH3、AcH4的水平无明显变化,CpG岛甲基化状态没有明显改变,但是ABCG2基因启动子区AcH3的水平升高。TSA能诱导K562、K562R细胞ABCG2的mRNA和蛋白表达水平,呈现剂量依赖性。TSA诱导后细胞内总的AcH3、AcH4的水平上调,ABCG2启动子区AcH3、AcH4的水平均明显升高,其启动子区CpG岛出现部分去甲基化。ABCG2抑制剂维拉帕米能增强TSA和伊马替尼联用的效果。
　　结论:1.K562R细胞ABCG2启动子区AcH3水平增加,ABCG2的高表达可能与ABCG2基因启动子组蛋白修饰有关。
　　2.TSA不但能上调ABCG2启动子区组蛋白乙酰化,而且可以调节CpG岛的甲基化,ABCG2的启动子区的超乙酰化和CpG岛的低甲基化可能协同作用,调控ABCG2的表达。
　　4.ABCG2的抑制剂维拉帕米与TSA/IM联用效果优于TSA/IM组,说明干预ABCG2可能增强HDACI的作用,减少不良反应。