脱氢表雄酮对支气管上皮细胞上皮间质转化的作用及机制

摘要

目的:采用转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)诱导人支气管上皮细胞株16HBE-14o构建上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)模型，观察脱氢表雄酮(Dehydroepiandrosterone，DHEA)对TGF-β1诱导的EMT的作用，并探讨其具体机制。
　　 方法:1.将16HBE-14o用含有5％胎牛血清的MEM培养基培养，5ng/ml TGF-β1作用16HBE-14o72h，观察细胞的形态变化，采用Westem Blot(WB)检测E-钙粘素(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)表达。2.给予不同浓度(1μM、10μM、100μM) DHEA预处理细胞24h，后加入TGF-β1干预72h，检测方法同1。3.设DHEA100(DHEA终浓度为100μM)+ TGF-β1组和TGF-β1组，在不同时间点(0、0.5h、1h、2h)采用WB检测两组细胞p-AKT及AKT的变化过程。4.分别予雄激素受体(androgenreceptor，AR)拮抗剂氟他胺、PI3K抑制剂LY294002(LY)或PI3K激动剂IGF-1预处理细胞，设八组，分别为(1)无处理组;(2) TGF-β1组;(3) DHEA100+ TGF-β1组;(4) DHEA100+ TGF-β1+氟他胺组;(5) TGF-β1+ LY组;(6) TGF-β1+ IGF-1组;(7) TGF-β1+ DHEA100+LY组;(8) TGF-β1+ DHEA100+ IGF-1组，TGF-β1共同干预1h后立即收集细胞，WB检测各组细胞p-AKT及AKT的变化。各组细胞加入TGF-β1培养72h后立即收集细胞，WB检测各组细胞E-cadherin、α-SMA表达。
　　 结果:1.TGF-β1作用72h后，细胞鹅卵石外观变为梭形，细胞间连接疏松。E-cadherin表达下降;α-SMA表达增强。2.不同浓度DHEA对TGF-β1诱导EMT均有抑制作用，且呈浓度依赖性，100μMDHEA抑制作用最强。3.TGF-β1组、DHEA100+ TGF-β1组均在TGF-β1处理后，p-AKT蛋白表达增加，1h达到高峰。DHEA抑制p-AKT蛋白表达，AKT蛋白表达无明显差异(P＞0.05）。4.氟他胺可减轻DHEA对p-AKT蛋白表达及EMT过程的抑制作用。5.LY可进一步降低p-AKT蛋白表达及EMT过程;IGF-1促进p-AKT蛋白表达及EMT发生。
　　 结论:1.TGF-β1能诱导16HBE-14o发生EMT。2.DHEA对TGF-β1诱导的EMT有抑制作用，且呈浓度依赖性。3.DHEA通过AR而发挥对TGF-β1诱导的EMT的抑制作用。4.DHEA对EMT的抑制作用与PI3K/AKT信号途径有关。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一章 材料与方法

1．1 实验对象

1．2 仪器设备及试剂

1．2．1 仪器设备

1．2．2 主要试剂与耗材

1．3 试剂的配制

1．4 实验方法

1．4．1 16HBE-14o细胞的培养

1．4．2 实验分组及给药方案

1．4．3 Western blot检测

1．5 统计分析

第二章 结果

2．1 TGF-β1诱导EMT模型的建立

2．2 不同浓度DHEA对TGF-β1诱导EMT的抑制作用

2．3 TGF-β1处理后不同时间点p-AKT及AKT蛋白表达变化

2．4 各组细胞p-AKT及AKT蛋白表达变化

2．5 各组细胞E-cadherin及α-SMA蛋白表达变化

2．5．1 各组细胞E-cadherin蛋白表达变化

2．5．2 各组细胞α-SMA蛋白表达变化

第三章 讨论

3．1 EMT与哮喘气道重塑的关系

3．2 TGF-β1诱导EMT模型的建立

3．3 DHEA通过AR发挥对EMT的作用

3．4 DHEA对EMT的抑制作用与PI3K/AKT途径有关

第四章 结论

参考文献

综述

致谢

攻读学位期间研究成果