内皮细胞特异性表达启动子的克隆

摘要

血友病A是由于凝血因子Ⅷ(hFⅧ)的功能缺陷导致的一种单基因遗传病。该遗传病的基因治疗策略一般是通过基因导入的方式使病人细胞能够表达正常的FⅧ。在这个过程中，组成型启动子(constitutive promoter)常常用来启动FⅧ的表达。但是在以往的研究中我们发现，组成型启动子在某些特定的细胞类型中并不能够有效地启动下游结构基因的表达。
　　 组织特异启动子(tissue-specific promoter)，不同于组成型启动子。在这类启动子调控下，基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达，并表现出发育调节的特性，因此也有着一些不可替代的优势。由于在正常机体内，FⅧ特异性表达于内皮细胞，因此我们试图克隆内皮细胞特异性表达启动子，并建立含有内皮细胞特异启动子启动报告基因表达的人胚胎干细胞(human embryonic stem cells，hESCs)系，用于后续hESCs向内皮细胞分化及血友病A基因治疗的研究。
　　 目的:构建并验证含有内皮细胞特异性表达报告基因的质粒。
　　 方法:1.建立从外周血、脐血、脐静脉中分离和培养内皮细胞的方法;2.构建GFP内皮细胞特异表达质粒。分别PCR扩增内皮细胞特异性表达基因vWF、VE-cadherin(CD144)转录起始位点上游启动子片段。用pEGFP-N1载体为骨架，以内皮细胞特异性表达基因的启动子完全取代CMV启动子，构建4个质粒:pvWF-1、pvWF-2、pVE-1、 pVE-2;3.用这些质粒分别转染新分离的原代内皮细胞、Huvec细胞系、hESCs证明其表达的特异性。
　　 结果:1.分别从外周血、脐血、脐静脉中分离得到可以在体外培养的具有内皮细胞特异性的细胞，建立稳定获取内皮细胞的方法;2.所构建的载体pvWF-1、pvWF-2、pVE-1、pVE-2经酶切鉴定，所获得酶切片段的大小与预期值相符;3.所构建的载体pvWF-1、pvWF-2、pVE-1、pVE-2测序结果与预期序列相符;4.构建好的质粒分别转染新分离的原代内皮细胞、Huvec细胞系后荧光显微镜下观察发现pVE-2的特异性最强，所克隆启动子的长度为2105kb。
　　 结论:本实验研究获得了含有GFP报告基因的质粒，该质粒可以在内皮细胞中特异性表达GFP。

目录

声明

摘要

中英文缩略词表

前言

1．材料

1．1 实验仪器

1．2 主要实验试剂及耗材

1．3 标本来源

1．4 引物：上海生工生物工程有限公司

1．5 人胚胎干细胞株

1．6 实验动物

1．7 主要试剂配制

2 方法

2．1 内皮细胞的分离及培养

2．2 内皮细胞表面标记和特异性表达分子的鉴定

2．3 质粒的构建

2．4 质粒的制备

2．5 MEF细胞的准备

2．6 hESCs的培养及扩增

2．7 细胞转染

3 结果

3．1 内皮细胞培养结果

3．2 免疫荧光结果

3．3 RT-PCR检测

3．4 PCR条件摸索结果

3．5 PCR产物T连后的测序结果

3．6 质粒酶切鉴定图

3．7 质粒测序结果图

3．8 细胞转染结果

4 讨论

5 结论

参考文献

综述

致谢

攻读硕士学位期间主要研究成果