共同抑制热休克蛋白90和哺乳动物雷帕霉素复合物2对白血病细胞的杀伤作用

摘要

研究背景:
　　激酶AKT或者PKC的持续激活可促进血液肿瘤的增殖存活，并且和病人的低生存率密切相关。当前的热点集中在对AKT激酶活性抑制剂的研究中，但我们发现哺乳动物雷帕霉素目标复合物2(mTORC2)能通过磷酸化高保守性转角结构域（turn motif TM）来直接调节AKT和PKC蛋白质的稳定性。细胞一旦缺乏mTORC2的功能，AKT和PKC的TM磷酸化被去除，这将损坏AKT和PCK蛋白质的稳定性。但是，分子伴侣热休克蛋白90(HSP90)可以稳定AKT和PKC蛋白质，并能重新建立这两种蛋白质的表达。在以前的研究中我们发现，在小鼠sin1-/-的胚胎成纤维细胞中，用17AAG抑制HSP90的功能，可抑制AKT蛋白质的合成。在此篇论文的研究中，我们以小鼠和人的肿瘤细胞为研究对像，通过抑制mTORC2和HSP90的功能来抑制AKT蛋白质的表达，并且我们证明在体外的培养环境中AKT的缺乏可抑制白血病细胞的生长并且促进白血病细胞的死亡。更进一步地我们证明17AAG可以在小鼠体内选择性地抑制mTORC2缺陷的白血病细胞的生长。此外，我们联合使用雷帕霉素(一种mTORC的抑制剂)和17AAG作用于白血病细胞，也可以抑制AKT蛋白质的表达并促进白血病细胞的死亡。此项研究为临床上联合使用mTOR的抑制剂和热休克蛋白抑制剂治疗血液系统肿瘤提供了理论上的依据。本研究分为以下三部分。
　　第一部分共抑制mTORC2和HSP90对AKT的影响
　　目的: 证明在小鼠或者人的白血病细胞中同时抑制mTORC2和HSP90的功能可降解蛋白质AKT，从而为联合使用此两种药物杀伤白血病细胞提供理论基础。
　　方法: ①用Ab-MuLV或者p210BCR-Abl病毒转染小鼠前B淋巴细胞，从而得到白血病细胞系;②将人sin1基因片段用逆转录病毒转染sin1缺失的白血病细胞，从而重建mTORC2的功能;③分别用17AAG或者17AAG+雷帕霉素加入培养基，培养特定时间后将白血病细胞裂解取得蛋白质，用Western Blot方法检测AKT蛋白质的含量;
　　结果: ①将HSP90抑制剂作用于mTORC2缺失的白血病细胞，4小时后即可观察到AKT蛋白质的降解;②将HSP90抑制剂作用于mTORC2重建的白血病细胞，mTORC2功能的重建可以保护蛋白质AKT，从而使其免于降解;③同时将mTORC2的抑制剂-雷帕霉素和HSP90的抑制剂-17AAG作用于白血病细胞，也可观察到AKT蛋白质的降解。
　　结论: 同时抑制mTORC2和HSP90的功能可在白血病细胞内降解蛋白质AKT。
　　第二部分共抑制mTORC2和HSP90体外对白血病细胞的作用
　　目的: 证明在体外环境中，白血病细胞缺乏蛋白质AKT可抑制其生长以及促进其死亡。
　　方法: 分别用17AAG或者17AAG+雷帕霉素加入培养基，培养特定时间后①用PI与AnnexinⅤ双染法检测凋亡与死亡细胞;②用台盼蓝拒染法计数活细胞。
　　结果: ①将HSP90抑制剂-17AAG作用于mTORC2缺失的白血病细胞，可观察到细胞停止生长并出现更多的死亡和凋亡细胞;②将HSP90的抑制剂-17AAG作用于mTORC2重建的白血病细胞，mTORC2功能的重建可以保护白血病细胞，减少细胞死亡;③同时将mTORC2抑制剂和HSP90的抑制剂作用于白血病细胞，可观察到白血病细胞停止生长并出现更多的死亡和凋亡细胞。
　　结论: 同时抑制mTORC2和HSP90的功能降解了AKT后可在体外抑制白血病细胞的生长并促进其死亡。
　　第三部分共抑制mTORC2和HSP90在小鼠体内的抗白血病效应
　　目的: 证明在小鼠体内环境中，同时抑制mTORC2和HSP90的功能降解蛋白质AKT后可减少白血病细胞的存活。
　　方法: 6-8周龄健康成年Peb3b(CD45.1+)小鼠，体重20-24g。经亚致死量放射处理(300cGy)后随机分为WT对照组，WT药物治疗组，KO对照组，KO药物治疗组。WT对照组为:经尾静脉注射2x106个WT p210 BCR-Abl白血病细胞，并且经腹腔注射药物载体（玉米油）;WT药物治疗组:经尾静脉注射2x106个WT p210BCR-Abl白血病细胞，并且经腹腔注射药物17AAG; KO对照组为:经尾静脉注射2x106个sin1-/-p210 BCR-Abl白血病细胞，并且经腹腔注射药物载体（玉米油）;KO药物治疗组:经尾静脉注射2x106个sin1-/-p210 BCR-Abl白血病细胞，并且经腹腔注射药物17AAG.药物剂量为80mg/kg/天，从移植完成24h后起，持续5天。小鼠在结束药物注射2天后被处死。用流式细胞术分析骨髓细胞中Sin1+/+或者sin1-/-白血病细胞的比例。
　　结果: ①经HSP90抑制剂-17AAG处理一周后，小鼠骨髓中sin1-/-p210 BCR-Abl的白血病细胞少于野生型小鼠骨髓中的白血病细胞;②经HSP90抑制剂处理一周后，、小鼠肝脏中的sin1-/-p210BCR-Abl白血病细胞少于野生型小鼠肝脏中的白血病细胞。
　　结论: 同时抑制mTORC2和HSP90的功能可在小鼠体内抑制白血病细胞的生长。

目录

声明

论文说明

摘要

英文缩写注解

前言

第一章 共抑制mTORC2和HSP90对AKT的影响

1．1 材料

1．2 方法

1．3 结果

1．4 结论

1．5 讨论

第二章 共抑制mTORC2和HSP90体外对白血病细胞的作用

2．1 材料

2．2 方法

2．3 结果

2．4 结论

2．5 讨论

第三章 共抑制mTORC2和HSP90在小鼠体内的抗白血病效应

3．1 材料

3．2 方法

3．3 结果

3．4 结论

3．5 讨论

结论

参考文献

综述 AKT／mTORC和HSP90与血液系统恶性疾病的关系

致谢

在读期间的主要研究成果