全长人源抗肝癌哺乳动物细胞表面展示抗体基因库的构建及初步研究

摘要

第一章 EGFL7的生物信息学分析
　　目的:采用生物信息学方法分析EGFL7基因表达谱和密码子偏好性，并重点对蛋白质的理化性质、结构功能特点和抗原表位进行预测。
　　方法:利用各种生物信息学分析数据库和在线软件资源对EGFL7基因进行预测分析。
　　结果:通过生物信息学分析，EGFL7基因的ORF全长1569 bp，编码一种含273个氨基酸的蛋白，蛋白质预计分子量约30kDa。EGFL7蛋白在人正常肝组织中有少量表达。密码子偏好性分析发现稀有密码子所编码的氨基酸占总氨基酸数目的21％。在大肠杆菌体内蛋白质的代谢半衰期大于10小时。信号肽预测分析显示EGFL7蛋白有明显的N端信号肽序列。EGFL7蛋白定位在胞质为主，该蛋白存在着一个很弱的跨膜螺旋。EGFL7从属于EGF基因超家族，存在EGF保守结构域。antigic软件分析EGFL7蛋白有12个可能的抗原位点。
　　结论:用生物信息学的方法成功预测了EGFL7的结构和功能，为后续实验顺利进行提供指导。
　　第二章 EGFL7融合蛋白的原核表达、纯化及活性鉴定
　　目的:构建pET21 a(+)-TRX-EGFL7原核表达载体，高效表达、纯化EGFL7蛋白，并对其表达产物作活性鉴定。
　　方法:利用分子克隆技术将EGFL7插入到原核表达载体pET22a(+)-TRX中，转化入E.coli DH5α，经菌落PCR、双酶切验证并测序。将阳性重组子转化入表达菌株E.coli Rosetta(DE3)，经IPTG诱导表达后，表达的重组蛋白经His-tag纯化试剂盒纯化后复性。ELISA方法分析其蛋白活性。
　　结果:构建的原核表达载体pET21 a(+)-TRX-EGFL7经测序验证，序列正确。蛋白EGFL7以包涵体形式高效表达，经纯化后纯度达90％以上。ELISA方法鉴定复性后的蛋白具有结合活性，能够用于后续抗原实验用。
　　结论:成功获得了有活性的EGFL7蛋白，为筛选EGFL7展示抗体奠定了坚实的基础。
　　第三章 用于在哺乳动物细胞表面展示全长抗体的真核表达载体pcDNA3-CHm和pcDNA3-CLm的构建
　　目的:在载体pcDNA3-CH和pcDNA3-CL的基础上构建哺乳动物细胞表面展示全长抗体的真核表达载体pcDNA3-CHm和pcDNA3-CLm。
　　方法:根据载体pcDNA3-CL中的序列，设计多条PCR特异性扩增引物，扩增出片段fragment1和fragment2。应用两片段融合PCR的方法将两片段融合为一个片段fragment3，在fragment3的5'端和3'端分别引入了酶切位点HindⅢ、EcoRⅠ，通过克隆构建真核表达载体pcDNA3-CLm。分两步克隆来对载体pcDNA3-CH进行必要的改造，首先根据载体pcDNA3-CH中的序列，设计多条PCR特异性扩增引物，扩增出片段fragment4和fragment5。应用两片段融合PCR的方法将两片段融合为一个片段fragment6，在fragment3的5'端和3'端分别引入了酶切位点SacⅡ、XhoⅠ。并通过这两个酶切位点将片段fragment6连接入载体中。第二步克隆，设计引物扩增出片段fragment7，在fragment3的5'端和3'端分别引入了酶切位点HindⅢ、NheⅠ，通过克隆构建真核表达载体pcDNA3-CHm。
　　结果:获得的真核表达载体pcDNA3-CHm和pcDNA3-CLm，通过必要的酶切鉴定均可得到与理论上大小一致的片段，并通过序列测定结果表明成功构建了载体pcDNA3-CHm和pcDNA3-CLm。
　　结论:通过载体的优化改造，获得了能用于快速构建大容量基因库和展示全长人源抗体的真核表达载体pcDNA3-CHm和pcDNA3-CLm。
　　第四章 全长人源抗肝癌哺乳动物细胞表面展示抗体基因库的构建
　　目的:构建全长人源抗肝癌哺乳动物细胞表面展示抗体基因库，筛选抗EGFL7表面展示抗体，为下一步筛选天然抗体奠定基础。
　　方法:分离肝癌患者的外周血单核细胞，提取总RNA，设计并合成引物，用RT-PCR扩增重轻链可变区基因，用限制性内切酶NheⅠ、ClaⅠ双酶切，与NheⅠ、ClaⅠ双酶切之后的真核表达载体pcDNA3-CHm及pcDNA3-CLm连接，转化感受态大肠杆菌TOP10，根据长出的克隆数计算重、轻链抗体基因库库容量。分别随机挑选10个克隆接种过夜，取少量菌液送测序。对重、轻链抗体基因库进行大量质粒抽提，质粒共转染HEK293T细胞，细胞继续培养48-72 h后，以EGFL7为抗原结合磁珠分选和Cell ELISA检测筛选抗EGFL7表面展示抗体。
　　结果:电泳图上可见到明显的28 S与18S条带，说明mRNA的完整性好。RT-PCR扩增到VH和VL，酶切产物后插入载体并导入感受态细菌TOP10，分别构建了抗体重链基因库和轻链基因库。库容量分别为1.54×105和1.21×105，随机挑选了10个克隆进行DNA序列测定，理论上抗体库的多样性可以达到1.54×105×80％×1.21×105×90％=1.342×1010。以EGFL7为筛选抗原，采用磁珠分选和CellELISA检测筛选到抗EGFL7全长人源细胞表面展示抗体。
　　结论:采用哺乳动物细胞表面展示技术成功构建了一个库容量高达1.342×1010全长人源抗肝癌抗体基因库，并筛选到抗EGFL7表面展示抗体。
　　第五章 全长人源抗肝癌EGFL7可溶性抗体的构建及表达
　　目的:全长人源抗EGFL7可溶性抗体的真核表达载体构建并实现在HEK293T细胞中的表达。
　　方法:通过RT-PCR技术分别扩增抗EGFL7细胞展示抗体的重链与轻链可变区基因片段;利用分析软件对轻重链基因分别进行同源性比较。将经过测序确认的基因序列分别构建入表达载体中转染HEK293T细胞。对抗体进行分子建模，模拟其蛋白质三级结构。收集细胞培养上清，通过ELESA检测抗体特异性结合的能力;并进一步验证该重组抗体结构的完整和功能的有效性。
　　结果:RT-PCR扩增出的重轻链基因片段经凝胶电泳鉴定，其片段大小与理论值相符，测序鉴定显示其序列正确。经分析软件对抗体可变区基因多样性分析，发现有2种不同抗体轻链可变区基因型和2种不同抗体重链可变区基因型，通过HEK293T细胞对抗EGFL7抗体可溶性表达，通过ELISA发现其中重链H2和轻链L3共转染的抗体上清与EGFL7抗原亲和力结合最高。进一步实验显示该重组抗体结构的完整性。
　　结论:成功地构建了抗EGFL7可溶性抗体真核表达载体，并获得了具有一定亲和力活性的抗体分子。为后续全长全人源哺乳动物细胞表面展示抗体基因库的进一步发展及研究提供了坚实的基础。