PPAR-β对成纤维细胞热损伤变性的保护作用及其机制研究

摘要

目的:
　　探讨PPARβ对成纤维细胞热损伤变性的保护作用及其作用机制。
　　方法:
　　1、采用体外组织细胞培养技术培养离体乳鼠真皮成纤维细胞和NIH3T3成纤维细胞。将培养好的成纤维细胞分为热损伤组(heatinjury)（52℃热水浴加热30秒）和正常对照组(normal)。于24h，48h，72h，96h不同时相点采用MTT法检测热损伤组和正常对照组细胞的生长曲线和存活率;于24h采用倒置显微镜、电镜和Westernblot技术对热损伤组和正常对照组细胞的形态结构和PPARβ的表达进行比较。
　　2、运用PPARβ shRNA质粒对乳鼠真皮成纤维细胞和NIH3T3成纤维细胞进行RNA干扰，两种细胞各分为PPARβ shRNA组、shRNA control对照组和空白对照组;采用PPARβ特异激动剂GW0742(10-6M)干预乳鼠真皮成纤维细胞和NIH3T3细胞，两种细胞各分为GW0742组、DMSO对照组和空白对照组。经52℃热水浴加热30秒处理，建立成纤维细胞热损伤变性模型。于24h时相点，分别采用电镜，流式细胞技术，Western blot技术检测乳鼠真皮成纤维细胞和NIH3T3细胞各六组细胞热损伤变性后细胞结构，生长周期及PCNA表达，观察PPARβ对于热损伤变性成纤维细胞结构和生长增殖的影响。
　　3、采用HSF1表达质粒转染NIH3T3成纤维细胞，建立高表达HSF1的细胞株。运用RT-PCR和Western blot技术检测NIH3T3成纤维细胞热损伤变性(52℃，30s)后PPARβ的表达。多个独立样本采用单因素方差分析，两指标间相关分析用T检验的统计学方法分析结果数据，P＜0.05为差异有统计学意义。
　　结果:
　　1.采用52℃，30s热水浴损伤条件，成功诱导出乳鼠真皮成纤维细胞和NIH3T3成纤维细胞热损伤变性模型。热损伤变性的乳鼠真皮成纤维细胞和NIH3T3细胞的生长曲线在热损伤后24h时相点达到最低值，后逐渐开始恢复。24h时相点，热损伤变性的两种成纤维细胞生存率分别为50.6％和49.6％，都有统计学意义(P＜0.05)。倒置显微镜和透射电镜观察热损伤变性的乳鼠真皮成纤维细胞和NIH3T3细胞均显示细胞胞浆出现大量空泡样物质，线粒体和内质网明显受损，两种细胞的损伤情况十分相似。乳鼠真皮成纤维细胞和NIH3T3细胞热损伤变性后，热损伤组PPARβ的表达量与正常对照组比较均增高(P＜0.05)。
　　2.用RNA干扰技术沉默PPARβ，乳鼠真皮成纤维细胞和NIH3T3细胞热损伤变性后，电镜观察乳鼠真皮成纤维细胞和NIH3T3细胞shRNA组细胞结构破坏情况相似，结构损伤情况与对照组比较更加严重，出现胞膜和核膜的破坏，核边聚固缩的现象。流式细胞周期检测，shRNA组乳鼠真皮成纤维细胞的G0/G1期细胞百分率为(76.5±1.77)，NIH3T3细胞的G0/G1期细胞百分率为(77.5±0.77)，分别明显高于乳鼠真皮成纤维细胞空白对照组(50.3±2.28)、阴性对照组(50.7±1.78)和NIH3T3细胞空白对照组(50.3±0.2)、阴性对照组(50.4±1.21)(P＜0.05)。乳鼠真皮成纤维细胞的G2/M、S期细胞百分率为(7.8±1.23和13.6±0.84)，NIH3T3细胞的G2/M、S期细胞百分率为(9.2±1.13和12.8±1.84)，分别低于乳鼠真皮成纤维细胞空白对照组(12.5±2.07和36.5±2.38)、阴性对照组(13.0±0.67和36.1±1.46)和NIH3T3细胞空白对照组(16.3±0.39和31.8±1.38)、阴性对照组（16.6±0.39和33.8±2.32）(P＜0.05)。shRNA组乳鼠真皮成纤维细胞增殖指数(0.22)，NIH3T3细胞增殖指数(0.22)，分别明显低于乳鼠真皮成纤维细胞空白对照组(0.49)、阴性对照组(0.49)和NIH3T3细胞空白对照组(0.49)、阴性对照组(0.50)(P＜0.05)。Western blot显示，shRNA组的乳鼠真皮成纤维细胞和NIH3T3细胞的PNCA表达量与对照组比较分别降低了61.5％和52.7％(P＜0.05)。
　　3.采用特异性激动剂GW0742激动PPARβ，乳鼠真皮成纤维细胞和NIH3T3细胞热损伤变性后，电镜观察乳鼠真皮成纤维细胞和NIH3T3细胞GW0742组细胞损伤情况十分相似，细胞结构与对照组相比更为完整，胞浆内空泡结构减少，核仁清晰。流式细胞周期检测，GW0742组乳鼠真皮成纤维细胞的G0/G1期细胞百分率为(38.5±3.06)，NIH3T3细胞的G0/G1期细胞百分率为(40.1±3.27)，分别明显低于乳鼠真皮成纤维细胞空白对照组(50.4±1.43)、阴性对照组(50.2±2.15)和NIH3T3细胞空白对照组(56.4±1.43)、阴性对照组(56.2±2.15)(P＜0.05)。乳鼠真皮成纤维细胞的G2/M、S期细胞百分率为(21.3±1.57和42.8±1.38)，NIH3T3细胞的G2/M、S期细胞百分率为(16.8±3.17和44.3±1.15)，分别高于乳鼠真皮成纤维细胞空白对照组(10.8±2.56和38.7±2.29)、阴性对照组(10.5±1.26和38.4±1.49)和NIH3T3细胞空白对照组(10.7±2.56和31.6±2.29)、阴性对照组(11.5±1.26和33.4±1.49)(P＜0.05)。GW0742组乳鼠真皮成纤维细胞增殖指数(0.62)，NIH3T3细胞增殖指数(0.61)，分别明显高于乳鼠真皮成纤维细胞空白对照组(0.50)、阴性对照组(0.49)和NIH3T3细胞空白对照组(0.42)、阴性对照组(0.42)(P＜0.05)。Western blot显示，GW0742组的乳鼠真皮成纤维细胞和NIH3T3细胞的PNCA表达量与对照组比较分别增加了67.7％和47.3％(P＜0.05)。
　　4.上调表达HSF1的NIH3T3细胞遭受热损伤后，采用RT-PCR和Western blot显示PPARβ的表达量均增加(P＜0.05)。
　　结论:
　　1.采用52℃，30s热水浴成功诱导离体鼠类成纤维细胞热损伤模型。热损伤变性的乳鼠真皮成纤维细胞和NIH3T3细胞的细胞结构和生长情况相似:胞浆结构损伤严重，胞核未见明显损伤，24h时相点成纤维细胞生长增殖减低最严重，后逐渐恢复正常，生存率明显降低。热损伤乳鼠真皮成纤维细胞和NIH3T3细胞均显示PPARβ的表达量增高。
　　2.shRNA组乳鼠真皮成纤维细胞和NIH3T3细胞结构损伤更为严重，处于分裂期的细胞百分比降低，处于静止期细胞百分比增高，增殖能力降低。而GW0742组乳鼠真皮成纤维细胞和NIH3T3细胞经热损伤变性后，细胞结构损伤比较对照组细胞减弱，处于分裂期的细胞百分比增高，增殖能力提高。PPARβ对热损伤变性的乳鼠真皮成纤维细胞和NIH3T3细胞的结构和生长增殖具有保护作用。
　　3.转染HSF1的NIH3T3成纤维细胞热损伤变性后，该细胞PPARβ的表达上调，初步证实HSF1通过上调PPARβ而对热损伤变性后成纤维细胞发挥保护作用。

目录

声明

摘要

缩略词

引言

第一章 成纤维细胞热损伤模型的建立和成纤维细胞热损伤PPARβ表达的变化

1．1 材料

1．1．1 主要试剂

1．1．2 主要试剂配制方法

1．1．3 主要仪器

1．1．4 细胞株和动物

1．2 方法

1．2．1 细胞培养

1．2．2 成纤维细胞热损伤模型的制作

1．2．3 成纤维细胞生长曲线和生存率测定

1．2．4 一般形态变化的观察

1．2．5 Western blot分析热损伤后成纤维细胞中PPARβ蛋白的表达

1．2．6 统计方法

1．3 实验结果

1．3．1 正常培养的原代小鼠真皮成纤维细胞和NIH3T3细胞

1．3．2 52℃30s热损伤后成纤维细胞生长曲线

1．3．3 52℃30s热损伤后成纤维细胞生存率

1．3．4 倒置显微镜下观察热损伤成纤维细胞

1．3．5 电镜下观察热损伤成纤维细胞

1．3．6 52℃30s热损伤后成纤维细胞PPARβ蛋白含量的测定

1．4 讨论

1．5 结论

第二章 PPARβ对热损伤变性的成纤维细胞结构和增殖能力影响的实验研究

2．1 材料

2．1．1 主要试剂

2．1．2 主要仪器

2．2 方法

2．2．1 RNA干扰

2．2．2 PPARβ特异激动剂干预[1,14]

2．2．3 实验分组

2．2．4 RT-PCR分析RNA干扰后和PPARβ特异性激动剂干预后成纤维细胞中PPARβmRNA的表达

2．2．5 Western blot分析RNA干扰后和PPARβ特异性激动剂干预后成纤维细胞中PPARβ蛋白的表达

2．2．6 透射电镜观察热损伤成纤维细胞形态的改变

2．2．7 流式细胞仪检测热损伤成纤维细胞细胞周期

2．2．8 Western blot法检测增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白的表达

2．2．9 统计分析

2．3 结果

2．3．1 PPARβ shRNA转染后成纤维细胞PPARβ mRNA的变化

2．3．2 PPARβshRNA转染后成纤维细胞PPARβ蛋白的变化

2．3．3 电镜观察RNA干扰和特异激动剂干预的成纤维细胞热损伤变性后的结构

2．3．4 PPARβ基因对成纤维细胞热损伤后周期的影响

2．3．5 PPARβ基因对成纤维细胞热损伤后PCNA蛋白表达的影响

2．4 讨论

2．5 结论

第三章 HSF1调控PPARβ表达的分子机制的初步探讨

3．1 材料

3．1．1 主要试剂

3．1．2 主要仪器

3．2 方法

3．2．1 细胞转染

3．2．2 实验分组

3．2．3 RT-PCR分析转染后成纤维细胞中HSF1mRNA的表达和热损后成纤维细胞中PPARβ mRNA的表达

3．2．4 Western blot分析转染后成纤维细胞中HSF1蛋白的表达和热损后成纤维细胞PPARβ蛋白的表达

3．2．5 统计分析

3．3 结果

3．3．1 稳定转染HSF1的NIH3T3细胞HS1 mRNA的变化

3．3．2 稳定转染HSF1的NIH3T3细胞HSF1蛋白的变化

3．3．3 上调HSF1的NIH3T3细胞热损伤后PPARβ mRNA的变化

3．3．4 上调HSF1的成纤维细胞热损伤后PPARβ蛋白的变化

3．4 讨论

3．5 结论

全文总结

展望

参考文献

综述 过氧化物酶体增殖物激活受体在皮肤发育，修复和疾病的作用

致谢

攻读博士期间主要研究成果