HSF1对内毒素血症小鼠多器官损伤的保护作用及其机制

摘要

脓毒症(sepsis)是由感染引起的全身炎症反应综合征(systemicinflammatory response syndrome，SIRS)。虽然脓毒症的发生机制尚未完全阐明，但是革兰氏阴性细菌胞壁上的脂多糖(lipopolysacchride，LPS)即内毒素启动体内免疫系统在脓毒症发病中的重要性已受到广泛关注。LPS进入机体内可激活多条信号转导通路，启动宿主防御反应，导致大量炎症介质基因的过度表达和全身炎症细胞活化。脓毒症发生机制的核心是感染所引起的失控性炎症反应，其主要特征和机制是过度的中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophil，PMN)浸润，引起多器官损伤。
　　热休克因子1(heat shock factor1，HSF1)是调控热休克反应的关键转录因子。本室前期研究发现HSF1敲除小鼠(HSF1-/-)对LPS的敏感性显著增强和生存率明显降低，表明HSF1对LPS所致的内毒素血症具有保护作用。但是HSF1的保护机制目前仍不清楚。内毒素血症的主要特征和机制是大量中性粒细胞浸润肺、肝和肾等。HSF1是否影响LPS所致内毒素血症的中性粒细胞浸润？目前尚未见报道。
　　为了探讨HSF1对LPS所致的内毒素血症小鼠的多器官损伤的保护作用和可能机制，本研究第一章采用复制内毒素血症小鼠模型，在整体水平进行一系列组织细胞损伤指标测定和组织学分析。结果发现与野生型(wild type，WT)小鼠相比较，LPS注射4h引起HSF1-/-小鼠释放到血清的炎性介质（IL-6和G-CSF）和器官损伤酶学指标(LDH、BUN和ALT)水平明显升高，肺和肾微血管通透性和湿干比重显著升高。进一步研究发现LPS注射导致HSF1-/-小鼠肺、肝和肾等易感器官的中性粒细胞浸润明显增多，组织损伤更加明显，与LPS引起HSF1-/-小鼠的生存率显著降低相一致。上述结果表明HSF1对LPS诱导的多器官损伤具有保护作用，其机制与抑制过度的中性粒细胞浸润有关。
　　中性粒细胞浸润是涉及粘附和趋化作用的、受到精细调节的一个多步骤过程。最近，本室利用HSF1-/-和WT小鼠制备内毒素血症模型，采用含384个炎症因子基因的微阵列从内毒素血症小鼠肺组织中筛选HSF1调控的炎症相关基因，首次发现HSF1可能抑制与细胞的粘附和趋化有关的两个分子的表达:即细胞粘附分子P选择素糖蛋白配体(P-selectin glycoprotein ligand1，PSGL-1)和趋化因子受体XCR1。这提示HSF1对LPS所致内毒素血症的中性粒细胞的粘附和趋化作用可能存在抑制作用。
　　为了探讨HSF1对LPS所致的内毒素血症的中性粒细胞粘附作用的影响及其机制，本研究第二章采用HSF1-/-小鼠复制内毒素血症小鼠模型，运用抗粒细胞染色法在整体水平观察中性粒细胞与血管内皮细胞的粘附作用，发现LPS诱导HSF1-/-小鼠中性粒细胞与血管内皮细胞的粘附比WT小鼠中性粒细胞更强。进一步采用实时定量PCR检测骨髓中性粒细胞的PSGL-1 mRNA水平，采用细胞流式术检测用或不用抗PSGL-1单抗处理的内毒素血症小鼠的循环中性粒细胞表面的PSGL-1的蛋白表达水平，采用细胞流式术和免疫组化技术分别检测循环中性粒细胞表面的CD11b和血管内皮细胞表面的ICAM-1表达水平。结果显示，在基础水平，中性粒细胞表面的PSGL-1和CD11b表达水平比较低，而在HSF1-/-小鼠中性粒细胞的表达比WT更高。经LPS刺激后，中性粒细胞表达PSGL-1和CD11b上调，与WT组比，LPS诱导HSF1-/-中性粒细胞表面的PSGL-1和CD11b表达上调更显著。PSGL-1的蛋白表达变化与mRNA水平的变化十分相似。这表明HSF1可下调中性粒细胞表面的PSGL-1和CD11b的组成型表达与LPS所致的诱导型表达。另外，LPS诱导HSF1-/-小鼠的血管内皮细胞表面表达更高的ICAM-1水平。而LPS处理对WT和HSF1-/-中性粒细胞的Hsp70表达没有显著影响。这些结果表明在内毒素血症过程中，HSF1通过抑制中性粒细胞表面的PSGL-1和CD11b的上调以及血管内皮细胞表面的ICAM-1表达，从而抑制LPS所致的中性粒细胞与内皮细胞的粘附。
　　趋化性是吞噬细胞朝一些浓度递增的趋化物如细菌因子(LPS等)和趋化因子进行定向运动的特性。为了探讨HSF1对中性粒细胞趋化作用的影响及其机制，本研究第三章利用WT和HSF1-/-小鼠骨髓中性粒细胞，采用趋化实验在细胞水平观察两种不同基因型细胞对LPS或肺匀浆的趋化反应，发现HSF1-/-小鼠骨髓中性粒细胞对LPS或内毒素血症小鼠肺匀浆的趋化性比WT小鼠中性粒细胞明显增强。然后复制内毒素血症模型，在整体水平采用ELISA检测血清趋化因子MIP2和XCL1的水平，采用流式细胞术检测循环中性粒细胞表面的CXCR2的表达水平，采用实时定量PCR和细胞免疫荧光技术分别检测中性粒细胞的XCR1 mRNA和蛋白表达。结果发现LPS诱导WT和HSF1-/-小鼠循环中性粒细胞的CXCR2表达降低，在LPS注射的WT和HSF1-/-小鼠之间，两组循环中性粒细胞表面的CXCR2表达无明显差异。尽管经LPS注射后，WT和HSF1-/-小鼠血清MIP2水平都显著升高，但在WT和HSF1-/-之间没有明显的差异。然而，内毒素血症时，HSF1-/-小鼠循环中性粒细胞表面的XCR1表达水平和释放到血清的XCL1水平均明显高于WT小鼠。在体外，LPS诱导HSF1-/-小鼠骨髓中性粒细胞的XCR1 mRNA和蛋白水平显著增加。且随LPS处理时间的延长，HSF1-/-骨髓中性粒细胞表达的XCR1蛋白递增，而LPS对WT骨髓中性粒细胞的XCR1表达没有明显的影响。值得注意的是，在基础水平，HSF1-/-中性粒细胞的XCR1表达显著低于WT中性粒细胞。其机制目前仍不清楚。上述结果表明HSF1对LPS诱导的中性粒细胞表面的XCR1表达上调具有抑制作用。肌动蛋白细胞骨架和伪足小体形成的变化是迁移细胞的特点。为了明确HSF1-/-是否改变细胞骨架重排，我们研究了WT和HSF1-/-小鼠的循环中性粒细胞和骨髓中性粒细胞的F-actin重组。结果发现LPS诱导小鼠骨髓中性粒细胞形成富含F-actin的板状伪足。与WT小鼠相比，HSF1-/-小鼠骨髓中性粒细胞中显示富含F-actin的范围显著增加，这与HSF1-/-中性粒细胞的趋化性和迁移增强一致。此外，HSF1-/-骨髓中性粒细胞的F-actin聚合随体外LPS处理时间的延长而递增。而一旦用actin聚合的抑制剂即细胞松弛素B破坏F-actin，则WT和HSF1-/-小鼠中性粒细胞对LPS的趋化反应被完全废除。这些结果表明在内毒素血症过程中，HSF1通过抑制中性粒细胞表面的XCR1表达上调和血清趋化因子XCL1的产生，以及抑制LPS诱导的中性粒细胞的F-actin聚合，从而抑制中性粒细胞的趋化和迁移。
　　此外，在前期工作中我们通过生物信息学分析发现PSGL-1和XCR1基因的启动子区上游均含有一个热休克元件，因此HSF1可能在转录水平直接抑制psgl-1和xcr1基因的表达。
　　综上所述，本研究首次提出在小鼠内毒素血症过程中，HSF1对LPS诱导的多器官损伤的保护作用与抑制过度的中性粒细胞浸润有关。一方面，HSF1通过抑制LPS诱导的中性粒细胞表面的PSGL-1和CD11b的表达以及血管内皮细胞表面的ICAM-1表达而抑制中性粒细胞与血管内皮细胞的粘附;另一方面，HSF1通过抑制LPS诱导的XCL1产生，和中性粒细胞的XCR1表达以及F-actin聚合，从而抑制中性粒细胞的趋化和迁移。上述发现为揭示脓毒症的发病机制提供了新的实验依据，也为从HSF1角度探讨内毒素血症和脓毒症的防治提供新的思路与实验线索。

目录

声明

论文说明

摘要

英文缩略词简表

前言

技术路线

第一章 HSF1对内毒素血症小鼠多器官损伤的保护作用

1．1 材料与方法

1．1．1 材料

1．1．2 方法

1．2 结果

1．2．1 HSF1对内毒素血症小鼠生存率的影响

1．2．2 HSF1对内毒素血症小鼠血清IL-6和G-CSF水平的影响

1．2．3 HSF1对内毒素血症小鼠多器官损伤的影响

1．2．4 HSF1对内毒素血症小鼠多器官组织水肿的影响

1．2．5 HSF1对内毒素血症小鼠微血管通透性的影响

1．2．6 HSF1敲除促进LPS诱导的中性粒细胞聚集到易感器官

1．2．7 HSF1敲除加重LPS诱导的多组织损伤

1．3 讨论

1．4 结论

第二章 HSF1对内毒素血症小鼠中性粒细胞与血管内皮细胞粘附的抑制作用及其机制

2．1 材料与方法

2．1．1 材料

2．1．2 方法

2．2 结果

2．2．1 分离的骨髓中性粒细胞纯度和活力鉴定

2．2．2 HSF1对内毒素血症小鼠中性粒细胞与血管内皮细胞粘附的影响

2．2．3 HSF1对LPS诱导的中性粒细胞表面表达PSGL-1的影响

2．2．4 HSF1对内毒素血症小鼠中性粒细胞表面CD11b表达和内皮细胞表面ICAM-1表达的影响

2．2．5 LPS处理对中性粒细胞的Hsp70蛋白水平没有显著影响

2．3 讨论

2．4 结论

第三章 HSF1对内毒素血症小鼠中性粒细胞趋化的抑制作用及其机制

3．1 材料与方法

3．1．1 材料

3．1．2 方法

3．2 结果

3．2．1 HSF1对中性粒细胞体外趋化功能的影响

3．2．2 HSF1对内毒素血症小鼠血清中趋化因子水平的影响

3．2．3 HSF1对内毒素血症小鼠循环中性粒细胞表面趋化因子受体表达的影响

3．2．4 HSF1对LPS所致中性粒细胞F-actin表达的影响

3．3 讨论

3．4 结论

总结论

参考文献

综述1 热休克因子1与恶性肿瘤

综述2 趋化因子受体XCR1与其配体的研究进展

致谢

攻读学位期间的研究成果