Erbin缺失诱导宫颈癌细胞抗失巢凋亡

摘要

目的:细胞极性和形态的完整性对于上皮细胞行使正常的功能至关重要，上皮细胞极性丧失及形态完整性破坏与肿瘤的恶性转化密切相关。Erbin属LAP蛋白家族成员，该家族在维持上皮细胞的极性及完整性中发挥重要的作用。Erbin定位于上皮细胞基底外侧膜，早期研究认为，Erbin可能介导Her2受体的膜定位。但是，越来越多的研究发现，Erbin常与细胞粘附连接的组分相互作用或与某些参与细胞-基质粘附的蛋白形成复合物，提示Erbin可能参与细胞的粘附过程。近年来，Erbin作为支架分子在多条信号通路中的调控作用亦被逐一揭示。但是，Erbin具有多个蛋白质相互作用结构域，能与这些结构域相互作用的蛋白远未被完全发掘，Erbin的生物学功能亦远未被人们所认识。因此，本文旨在探索Erbin在肿瘤中的生物学功能。
　　方法:应用poly-HEMA包被的培养板模拟体外失粘附状态，通过流式细胞术分析Erbin缺失细胞以及对照细胞的凋亡。通过Western blot分析Erbin缺失对不同信号通路分子表达和磷酸化的影响。通过双荧光素酶报告基因分析，Erbin缺失后STAT3启动子活性的变化。应用免疫组化染色研究Erbin在宫颈癌组织中的表达。
　　结果:在本研究中，我们通过体内外实验，揭示Erbin缺失能增强宫颈癌细胞抵抗失巢凋亡的能力，促进宫颈癌移植瘤在裸鼠体内生长和转移。在宫颈癌细胞中敲低Erbin表达，可增强IL-6诱导的STAT3磷酸化、入核及转录激活活性。过表达组成性激活的STAT3C或通过IL-6激活内源性的STAT3均可明显抑制宫颈癌细胞的失巢凋亡，而JAK2/STAT3的抑制剂WP1066能逆转Erbin缺失诱导的抗失巢凋亡，表明宫颈癌细胞中Erbin缺失诱导的抗失巢凋亡是通过活化STAT3而实现的。我们发现，IL-6在诱导STAT3活化的同时，可导致Erbin表达上调，过表达STAT3C亦可显著诱导Erbin的表达，而JAK2的抑制剂AG490不仅能抑制STAT3的磷酸化，而且能抑制IL-6诱导的Erbin表达上调，敲低Erbin亦可增强IL-6诱导的STAT3活化，表明IL-6/STAT3/Erbin可能形成一个负反馈调控环路。我们通过免疫组化分析了宫颈癌组织中Erbin的表达，发现Erbin在宫颈癌组织中的表达水平普遍降低甚至缺失。
　　结论:以上结果证实，Erbin是一个STAT3信号通路的负调控分子，Erbin缺失导致的STAT3活化诱导宫颈癌细胞抗失巢凋亡，促进肿瘤在裸鼠体内生长及转移。

目录

声明

摘要

符号说明

1 前言

2 材料方法

2．1 细胞培养

2．2 siRNA的合成及转染

2．3 shRNA的构建

2．4 转染及感染

2．5 Western blot

2．6 实时定量RT-PCR

2．7 凋亡检测

2．8 集落形成实验

2．9 双荧光素酶测定

2．10 免疫荧光染色及激光共聚焦显微镜观察

2．11 组织芯片及免疫组化染色

2．12 体内失巢凋亡检测

2．13 体内肿瘤生长和转移

2．14 数据分析

3 结果

3．1 Erbin缺失导致失粘附状态下的宫颈癌细胞抗失巢凋亡

3．2 在宫颈癌细胞中Erbin缺失能诱导STAT3活化

3．3 Erbin缺失通过激活STAT3通路诱导宫颈癌细胞抗失巢凋亡

3．4 Erbin负调控IL-6／STAT3信号通路

3．5 敲低Erbin可促进宫颈癌移植瘤在裸鼠体内增殖及转移

4 讨论

5 结论

参考文献

综述 失巢凋亡及抗失巢凋亡机制研究进展

攻读学位期间主要的研究成果目录

致谢