多孔PLLA/n-HA/PES复合材料的制备、及其生物相容性的实验研究

摘要

目的:本文采用溶剂-粒子沥洗法制备高孔隙率L-聚乳酸/纳米羟基磷灰石/聚丁二酸乙二醇酯（PLLA/n-HA/PES）多孔复合材料，通过对PLLA合成、多孔材料的制作、材料的表征、体外降解性能、细胞实验及动物植入实验几个方面进行系统研究，探讨多孔复合材料对骨缺损的修复作用及其生物相容性，为临床应用提供一定的理论依据。
　　方法:
　　(1)以L-乳酸为原料，采用开环聚合法制备合适的粘均分子量的L-聚乳酸(PLLA)。再以PLLA、n-HA和PES为原料，采用溶剂-盐沥洗法制作PLLA/n-HA/PES多孔复合材料。
　　(2)在PES含量恒定的情况下，调节PLLA/n-HA比值，制作不同比例多孔PLLA/n-HA/PES复合材料。将不同比例的多孔PLLA/n-HA/PES复合材料在PBS缓冲溶液中进行降解，分别检测降解液中不同时间点下材料的失重率、吸水率、PH值、分子量及扫描电镜下的变化，以验证降解机制及适合植入动物体内的比例配置。
　　(3)将多孔PLLA/n-HA/PES复合材料的浸提液与成骨样细胞共同培养，根据细胞形态分析标准表及细胞毒性程度评价标准表对试验材料进行毒性分析;MTT法测定细胞在材料表面的粘附情况及增殖能力;吖啶橙染色行细胞计数;测定碱性磷酸酶含量;多孔PLLA/n-HA/PES复合材料与成骨样细胞共同培养，干燥后放入液氮中脆断，材料断面喷金，用SEM观察材料上细胞形态;皮肤致敏试验结果根据接触斑贴致敏反应的记分标准进行评价;全身急性毒性试验据材料毒性分级评价表进行分析;亚急性毒性试验根据器官指数及统计学分析;肌肉植入试验按照组织学评价标准进行分析。
　　(4)选择30只健康雌雄各半的新西兰大白兔，6月龄左右，体重2.8-3.5kg，并将随机分为三组，每组10只，分别为空白对照组、自体骨植入组、材料植入组。在术后2周、4周、6周、8周、12周、16周分别处理实验动物，大体观察及正位X线摄片观察愈合情况，利用Lane-Sandhu X线评分标准进行记分及分析;对于材料植入组，在上述时间点进行组织切片，利用Lane-Sandhu组织学评分标准进行记分及分析;环境扫描电镜扫描骨-材料界面，结合能谱观察多孔材料中骨组织生长情况及材料形貌变化;在术后4w、8w、12w和16w时进行骨痂骨密度(BMD)定量分析，以检测骨折愈合情况;在术后4w、8w、12w和16w时进行生物力学实验，以检测骨折愈合后生物力学情况。所有测定的结果应用统计学软件SPSS13.0进行统计学分析。
　　结果:
　　(1)成功制备出以PLLA、n-HA和PES为原料的多孔复合材料，红外光谱及核磁共振谱分析:材料纯度结构与理论相符;SEM下可见:孔径大小在150μm-300μm之间，微孔之间互相联通，微孔支架结构良好。
　　(2)在PES含量恒定的情况下，调节PLLA/n-HA比值为100/10;100/20;100/30;100/40;100/50，将不同比例的多孔复合材料在PBS缓冲溶液中进行降解，检测降解液中失重率、吸水率、PH值，并结合降解过程中SEM成像情况，得出在PES含量一定的情况下，多孔PLLA/n-HA/PES复合材料体外降解最合适质量分数比为:PLLA/n-HA=100/40。
　　(3)成骨细胞在多孔PLLA/n-HA/PES复合材料的浸提液中生长良好，受试材料为1级反应合格其无细胞毒性;MTT法测定和吖啶橙染色试验表明:受试材料具有低毒性，适合细胞生存增殖;碱性磷酸酶的变化，提示材料可诱导成骨;受试材料与成骨样细胞共同培养，进行SEM观察可见:细胞在受试材料表面粘附、生长;皮肤致敏试验
　　结果表明:多孔材料无皮肤致敏性;全身急性毒性试验结果表明:多孔材料不引起动物全身毒性反应，符合生物材料制品要求;亚急性毒性试验结果表明:受试材料不引起动物主要器官坏死或发生异常变化;肌肉植入试验结果表明:受试材料不引起肌肉及组织坏死或变异。
　　(4)动物实验结果:大体观察:植入材料不引起组织溃烂，肌肉萎缩以及炎症脓肿现象出现，伤口愈合良好。行X线摄片、组织学切片及扫描电镜显示:材料植入组中材料和骨组织结合紧密，16周后，受试材料完全降解，取而代之的为骨组织;骨密度实验进行骨痂骨密度定量分析显示:术后16w材料植入组和自体骨植入组两组新生骨密度(BMD)整体比较不具有显著性差异(p＞0.05);力学实验提示:术后16w材料植入组和自体骨植入组两组整体抗压能力整体没有显著性差异(p＞0.05)，这说明两组之间骨形成能力没有显著性差异，多孔复合材料具有和自体骨相当的成骨能力。
　　结论:
　　(1)制备了高孔隙率的多孔PLLA/n-HA/PES复合材料，具有细胞生长的空间结构。
　　(2)验证了多孔PLLA/n-HA/PES复合材料体外降解最合适质量分数比为:PLLA/n-HA=100/40。
　　(3)体外试验及动物实验证明多孔PLLA/n-HA/PES复合材料具有良好的生物相容性及诱导成骨的作用。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

1 多孔PLLA／n-HA／PES复合材料的制备与表征

1．1 多孔PLLA／n-HA／PES复合材料的制备

1．1．1 实验试剂和设备

1．1．2 原料制备

1．1．3 多孔PLLA／n-HA／PES复合材料的制备

1．1．4 多孔PPLA／n-HA／PES薄膜的制备

1．2 材料的表征

1．3 结果

1．3．1 L-丙交酯的表征

1．3．2 PLLA的表征

1．3．3 纳米羟基磷灰石(n-HA)的表征

1．3．4 多孔PPLA／n-HA／PES复合材料的表征

1．4 讨论

1．5 小结

2 多孔PLLA／n-HA／PES复合材料的体外降解实验

2．1 试剂和仪器

2．1．1 试剂

2．1．2 仪器

2．2 模拟体液的配置

2．3 材料及方法

2．3．1 材料

2．3．2 方法

2．4 结果

2．4．1 PH值的变化

2．4．2 失重率的变化

2．4．3 吸水率的变化

2．4．4 多孔PLLA／n-HA／PES复合材料降解时SEM形貌变化

2．5 讨论

2．6 小结

3 多孔PLLA／n-HA／PES复合材料的生物相容性

3．1．细胞毒性试验

3．1．1 材料

3．1．2 试剂

3．1．3 主要仪器

3．1．4 试验方法

3．1．5 结果

3．2 动物实验

3．2．1 皮肤致敏试验

3．2．2 全身急性毒性试验

3．2．3 亚急性毒性试验

3．2．4 肌肉植入试验

3．3 讨论

3．4 小结

4 多孔PLLA／n-HA／PES复合材料的动物实验

4．1 材料与方法

4．1．1 材料

4．1．2 仪器

4．1．3 方法

4．1．4 标本的取材

4．1．5 并发症

4．1．6 实验准备及步骤

4．1．7 评价方法

4．2 结果

4．2．1 X-ray检查

4．2．2 组织学观察

4．2．3 电镜扫描

4．2．4 骨痂骨密度

4．2．5 生物力学

4．3 讨论

4．4 小结

5 结论

参考文献

综述 骨组织工程支架材料的应用与进展

攻读学位期间主要的研究成果

致谢