P2Y12和GPⅡb基因多态性对替格瑞洛体外抗血小板活性的影响

摘要

背景:替格瑞洛是首个可逆的口服P2Y12受体拮抗剂，能直接、可逆性地拮抗血小板表面P2Y12受体，阻止与之耦联的血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(GPⅡb/Ⅲa)与纤维蛋白原的结合，从而抑制血小板聚集。研究表明，作为抗血小板药物的作用靶点，P2Y12受体基因多态性与ADP诱导的血小板聚集、外周动脉疾病和冠心病易感性以及氯吡格雷疗效相关。GPⅡb/Ⅲa受体能结合VWF、纤维蛋白原等多种粘附蛋白，是各种因素所致血小板粘附与聚集的最终共同通路;GPⅡb/Ⅲa基因多态性则与阿司匹林抵抗以及缺血性脑卒中、心肌梗死以及冠心病发病风险相关。近年来少数几项基于高加索人群进行的研究表明，替格瑞洛的抗血小板活性不受基因多态性的影响;中国人群中相关基因的遗传变异与替格瑞洛反应性的关系尚无文献报道。
　　目的:查明P2Y12和GPⅡb基因多态性对中国健康人群替格瑞洛体外抗血小板活性的影响，识别潜在可引起替格瑞洛疗效个体差异的遗传变异。
　　方法:收集196名健康中国男性受试者外周血标本，分离富血小板血浆PRP，PRP分别用15μM和50μM替格瑞洛孵育5分钟，比浊法测定ADP诱导的空白血浆与替格瑞洛孵育后血浆的血小板聚集率，计算替格瑞洛对血小板最大聚集抑制率（IPA-15-Peak/IPA-50-Peak）和5min聚集抑制率（IPA-15-Late/IPA-50-Late）。酚氯仿抽提法提取所有受试者外周血DNA，通过聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)和PCR产物Sanger测序对P2Y12基因的9个单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)rs1907637、rs79320243、rs10935842、rs6787801、rs6801273、rs16863323、rs2046934、rs6785930和rs6809699以及GPⅡb基因的rs5911多态性进行基因分型。Haploview4.2与PHASE2.0分析P2Y12基因SNP间的连锁不平衡程度、单倍型及单倍型标签SNP。单因素方差分析(ANOVA)、Mann-WhitneyU检验和最小显著差数(leastsignificantdifference，LSD)法比较不同基因型间血小板聚集抑制率的差异。Haplo.stats软件包比较不同单倍型间血小板聚集抑制率的差异。
　　结果:中国人群中P2Y12基因rs1907637C＞T、rs79320243A＞G、rs10935842A＞T、rs6787801T＞C、rs6801273A＞G、rs16863323G＞A、rs2046934T＞C、rs6785930C＞T和rs6809699G＞T多态性位点低频等位基因的频率分别为22.96％、32.91％、37.24％、37.24％、28.83、37.5％、21.43％、14.29％和15.82％;GPⅡbrs5911T＞G多态位点低频等位基因的频率为38.52％。
　　Rs16863323GA基因型个体IPA-50-Peak较AA基因型个体高6.63％(P＜0.05)，且GA基因型个体IPA-50-Late较GG基因型个体高10.0％(P＜0.05);与rs6785930CC基因型个体相比，CT基因型个体50μM替格瑞洛的血小板最大聚集抑制率（IPA-50-Peak）与5min聚集抑制率（IPA-50-Late）分别高7.14％和9.02％(P均小于0.05)。GPⅡbrs5911多态性位点GT基因型个体IPA-50-Peak显著高于GG基因型个体(P＜0.05)。其他7个SNP位点基因型与替格瑞洛体外抗血小板活性均无显著相关(P＞0.05)。单倍型分析结果提示，P2Y12基因位点存在9中频率＞1％的单倍型;以最常见的单倍型H1为参考单倍型分析结果发现，单倍型H9与15μM替格瑞洛对血小板最大聚集抑制率（IPA-15-Peak）的升高显著关联(P＜0.005)，其他8种单倍型均与替格瑞洛体外抗血小板活性无显著关联。
　　结论:P2Y12基因rs6785930C＞T和rs16863323G＞A两个SNP位点单独以及P2Y12单倍型H9、GPⅡb基因rs5911T＞G基因多态性与替格瑞洛的体外抗血小板效应相关。

目录

声明

摘要

缩略词

第一章 研究背景

第二章 材料和方法

2．1 主要试剂和药品

2．2 主要仪器

2．3 主要溶液的配制

2．4 实验对象

2．5 实验方法

2．6 统计分析

第三章 结果

3．1 健康志愿者基础状态的血小板聚集率

3．2 健康志愿者替格瑞洛的血小板聚集抑制率

3．3 HapMap数据库中国人群P2Y12和GPⅡb基因SNPs连锁不平衡分析

3．4 10个候选SNPs基因分型结果

3．5 P2Y12基因候选SNPs连锁不平衡分析

3．6 各SNPs不同基因型与基础状态的血小板聚集率

3．7 各SNPs不同基因型与替格瑞洛的血小板聚集抑制率

3．8 P2Y12基因单倍型与基础状态血小板聚集率及替格瑞洛的血小板抑制率

附图及附表

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

综述：抗血小板药替格瑞洛药代药效动力学及遗传药理学研究进展

攻读学位期间主要研究成果

致谢