杜仲木脂素对血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响及其机制

摘要

目的:研究杜仲木脂素对血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响及其机制。
　　方法:采用大鼠肾小球系膜细胞(HBZY-1)作为实验材料，实验共分为6组:空白对照组、AngⅡ诱导模型组（10-8mol/LAngⅡ）、醛糖还原酶抑制剂依帕司他组（10-8mol/LAngⅡ+20μmol/L依帕司他）以及低浓度（10-8mol/LAngⅡ+20mg/L杜仲木脂素）、中浓度（10-8mol/LAngⅡ+40mg/L杜仲木脂素）和高浓度杜仲木脂素组(10-8mol/LAngⅡ+80mg/L杜仲木脂素)。各组细胞在含10％胎牛血清培养基中孵育24、36、48h，采用MTT一步法检测OD490值来评估细胞数目;采用流式细胞仪检测各组细胞周期和细胞凋亡;采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)法和蛋白质印迹(Westernblot)法检测细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂-P21、P27、细胞凋亡相关基因-Bax、Bcl-2和醛糖还原酶(AR)的mRNA和蛋白表达水平;采用紫外法检测细胞内AR的活性。
　　结果:(1)与对照组相比，模型组在含10％胎牛血清培养基中孵育48h，细胞数目显著增加，差异具有统计学意义（1.91±0.06vs1.49±0.08，P＜0.001）;与模型组比较，依帕司他和不同浓度木脂素组细胞数目减少，差异均具有统计学意义（1.60±0.04，1.60±0.03，1.58±0.07，1.52±0.04vs1.91±0.06;P值均小于0.001）。提示AngⅡ可促进大鼠肾小球系膜细胞增殖，依帕司他和杜仲木脂素可抑制增殖。
　　(2)与对照组相比，模型组G1期细胞比例明显减少（69.2％±0.3％vs73.9％±0.6％，P=0.024），S期细胞明显增多（22.4％±1.1％vs12.6％±0.2％，P＜0.001），差异均具有统计学意义;与模型组相比，依帕司他组和不同浓度杜仲木脂素组可抑制细胞进入S期，S期细胞比例明显下降（11.1％±0.4％，14.0％±0.6％，10.1％±0.2％，7.1％±0.7％vs22.4％±1.1％;P值均小于0.001），四组中高浓度杜仲木脂素组G1期的细胞比例增大具有统计学意义（76.4％±1.4％，73.5％±2.5％，76.9％±4.1％，77.6％±0.7％vs69.2％±0.3％;P=0.136,P=0.766,P=0.719,P=0.009)。提示AngⅡ可以诱导静止细胞进入增殖活跃期，而依帕司他和杜仲木脂素可以阻止系膜细胞由G1期进入S期，将细胞阻滞在G1期，从而抑制增殖。
　　(3)与对照组相比，模型组P21、P27mRNA水平显著降低(P21:0.31±0.01vs1.00±0.03，P＜0.001;P27:0.30±0.03vs1.00±0.02，P＜0.001)，差异均具有统计学意义;与模型组相比，依帕司他组和不周浓度杜仲木脂素组P21、P27mRNA水平均显著高于模型组（P21:1.38±0.07，1.18±0.05，1.34±0.06，1.78±0.11vs1.00±0.03，P值均小于0.001;P27:1.45±0.05，1.17±0.05，1.50±0.06，2.10±0.03vs1.00±0.02，P值均小、于0.001），差异均具有统计学意义。
　　与mRNA表达相似，模型组P21、P27蛋白水平显著降低(P21:0.52±0.06vs1.00±0.14，P=0.004;P27:0.72±0.02vs1.00±0.12，P＜0.001)，差异均具有统计学意义;与模型组相比，依帕司他组和不同浓度杜仲木脂素组P21、P27蛋白水平均显著高于模型组（P21:3.21±0.12，2.23±0.15，3.23±0.23，5.24±0.22vs0.52±0.06，P值均小于0.001;P27:2.36±0.04，1.96±0.06，2.24±0.06，3.14±0.06vs0.72±0.02，P值均小于0.001），差异均具有统计学意义。提示周期素依赖激酶抑制因子P21和P27在依帕司他和杜仲木脂素调节HBZY-1细胞周期过程中发挥重要作用。
　　(4)与对照组相比，模型组细胞的凋亡率显著高于对照组（10.5％±0.3％vs8.7％±0.3％，P=0.001），差异均具有统计学意义;与模型组相比，依帕司他组和不同浓度杜仲木脂素组凋亡率显著增高（17.9％±0.6％，16.1％±0.3％，18.7％±0.2％，22.5％±0.9％vs10.5％±0.3％;P值均小于0.001），差异具有统计学意义，且杜仲木脂素浓度越大，凋亡率越高。提示依帕司他和杜仲木脂素可通过促使细胞凋亡的方式消除活化增殖的HBZY-1。
　　(5)与对照组相比，模型组Bax、Bcl-2mRNA水平显著增高(Bax:1.70±0.02vs1.00±0.08，P＜0.001;Bcl-2:1.34±0.06vs1.00±0.03，P＜0.001)，差异具有统计学意义;与AngⅡ组相比，依帕司他组和不同浓度杜仲木脂素组的BaxmRNA水平均显著高于模型组（2.25±0.02，1.89±0.02，2.30±0.01，3.29±0.10vs1.00±0.08;P＜0.001，P=0.001，P＜0.001，P＜0.001），差异具有统计学意义，且杜仲木脂素浓度越大，BaxmRNA水平越高;而依帕司他组和不同浓度杜仲木脂素组的Bcl-2mRNA水平与模型组无统计学差异(1.43±0.02，1.31±0.05，1.34±0.07，1.28±0.04vs1.34±0.06;P=0.056,P=0.435,P=0.942，P=0.167)。
　　与mRNA表达相似，模型组Bax、Bcl-2蛋白水平著增高(Bax:1.81±0.04vs1.00±0.05，P＜0.001;Bcl-2:2.24±0.10vs1.00±0.10，P＜0.001）差异具有统计学意义;与AngⅡ组相比，依帕司他组和不同浓度杜仲木脂素组的Bax蛋白水平均显著高于模型组（2.29±0.05，2.13±0.04，2.39±0.04，3.15±0.06vs1.81±0.04;P值均小于0.001），差异具有统计学意义，且杜仲木脂素浓度越大，Bax蛋白水平越高;而依帕司他组和不同浓度杜仲木脂素组的Bcl-2蛋白水平与模型组无统计学差异（2.21±0.09，2.31±0.12，2.28±0.12，2.29±0.02vs2.24±0.10;P=0.769，P=0.365，P=0.617，P=0.481）。提示细胞凋亡相关基因Bax和Bcl-2的表达在依帕司他和杜仲木脂素调节HBZY-1细胞凋亡过程中发挥重要作用。
　　(6)与对照组相比，模型组细胞内AR活性明显增加(0.19±0.03vs0.14±0.01，P=0.012)，差异具有统计学意义;与模型组相比，依帕司他组和不同浓度杜仲木脂素组细胞内AR活性显著下降（0.11±0.01，0.11±0.01，0.11±0.01，0.12±0.03vs0.19±0.03;P=0.001，P＜0.001，P=0.001，P=0.002），但四组之间并无明显差异。提示活化的AR可能会诱导HBZY-1的增殖，抑制AR的活性可以抑制HBZY-1的增殖。
　　(7)与对照组相比，模型组能够显著增加AR(1.35±0.04vs1.00±0.11，P＜0.001)mRNA水平，差异具有统计学意义;与模型组相比，依帕司他组的ARmRNA水平较模型组增加，差异具有统计学意义（3.78±0.13vs1.35±0.04，P＜0.001）;不同浓度杜仲木脂素均使ARmRNA水平低于模型组，差异具有统计学意义（1.08±0.03，0.98±0.09，0.86±0.08vs1.35±0.04;P值均小于0.001）。
　　与mRNA表达相似，模型组AR蛋白水平显著升高（2.02±0.08vs1.00±0.08，P=0.003），差异具有统计学意义;与模型组相比，依帕司他组的AR蛋白水平较模型组显著增加(3.13±0.24vs2.02±0.08，P=0.001)，不同浓度杜仲木脂素均使AR蛋白水平显著低于模型组（0.52±0.17，0.66±0.22，0.45±0.23vs2.02±0.08;P值均小于0.001），但不同杜仲木脂素浓度组间差异无统计学意义。提示AR的表达在依帕司他和杜仲木脂素抑制HBZY-1细胞增殖过程中发挥重要作用。
　　结论:依帕司他和杜仲木脂素能明显抑制AngⅡ诱导的系膜细胞增殖，其机制可能与其影响细胞周期调节基因P21和P27及细胞凋亡调节基因Bax的表达有关;AR可能在此过程中发挥了重要作用。

目录

声明

摘要

缩略词中英文对照表

第一章 前言

第二章 实验材料与方法

2．1 试剂、仪器及溶液配制

2．1．1 主要试剂

2．1．2 主要仪器

2．1．3 溶液配制

2．2 大鼠肾小球系膜细胞的培养

2．2．1 传代

2．2．2 冻存

2．2．3 复苏

2．3 实验设计和方法

2．3．1 杜仲木脂素对Ang Ⅱ诱导的HBZY-1增殖的影响

2．3．2 杜仲木脂素对Ang Ⅱ诱导HBZY-1细胞周期、细胞凋亡及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂P21、P27和细胞凋亡相关基因Bax、Bcl-2的影响

2．3．3 杜仲木脂素对Ang Ⅱ诱导的HBZY-1内AR的影响

2．4 统计学处理

第三章 结果

3．1 杜仲木脂素对Ang Ⅱ诱导的HBZY-1增殖的影响

3．1．1 不同浓度杜仲木脂素对HBZY-1生长的影响

3．1．2 不同浓度Ang Ⅱ对HBZY-1生长的影响

3．1．3 杜仲木脂素对Ang Ⅱ诱导的HBZY-1增殖的影响

3．2 杜仲木脂素对Ang Ⅱ诱导的HBZY-1细胞周期、细胞凋亡及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂P21、P27、细胞凋亡相关基因Bax、Bcl-2的影响

3．2．1 杜仲木脂素对Ang Ⅱ诱导的HBZY-1细胞周期及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂P21、P27的影响

3．2．2 杜仲木脂素对Ang Ⅱ诱导的HBZY-1细胞凋亡及凋亡相关基因BaX、Bcl-2的影响

3．3 杜仲木脂素对Ang Ⅱ诱导的HBZY-1内AR的影响

3．3．1 杜仲木脂素对Ang Ⅱ诱导的HBZY-1内AR活性的影响

3．3．2 杜仲木脂素对Ang Ⅱ诱导的HBZY-1内AR mRNA水平的影响

3．3．3 杜仲木脂素对Ang Ⅱ诱导的HBZY-1内AR蛋白水平的影响

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

综述 肾小球系膜细胞增殖抑制的研究进展

在读期间的研究成果

致谢