MicroRNA-376c靶向调控TGFA抑制骨肉瘤细胞增殖与转移的研究

摘要

目的:
　　为miR-376c可以通过靶向调控TGFA抑制骨肉瘤细胞增殖与转移提供证据。
　　方法:
　　1、临床选取13例骨肉瘤组织标本及配对正常骨骼肌组织标本;选取人正常成骨细胞为对照，选取三株骨肉瘤细胞作为实验组，QPCR技术检测骨肉瘤组织与细胞中miR-376c与TGFAmRNA的表达差异。
　　2、利用miR-376c模拟物转染骨肉瘤Saos-2细胞，Westernblot检测TGFA和EGFR的表达，接着过表达TGFA，回复miR-376c抑制TGFA和EGFR表达的效应。
　　3、利用双荧光素酶报告基因进一步验证miR-376c对TGFA的靶向调控作用。
　　4、构建miR-376c慢病毒载体，感染Saos-2细胞，用CCK8和Transwell方法检测miR-376c对Saos-2细胞增殖和侵袭能力的影响，接着过表达TGFA，回复miR-376c对Saos-2细胞的生物学效应。
　　结果:
　　1、组织水平QPCR结果显示，miR-376c在骨肉瘤组织中特异低表达，TGFA在骨肉瘤组织中特异高表达，且两者具有很好的负相关性;细胞水平QPCR结果显示，miR-376c在骨肉瘤细胞中特异低表达，TGFA在骨肉瘤细胞中特异高表达，与组织水平表达趋势一致。
　　2、miR-376c模拟物转染Saos-2细胞，miR-376c过表达，同时TGFA和EGFR表达受到显著抑制;当TGFA过表达后，可回复miR-376c抑制效应。
　　3、成功构建miR-376c慢病毒载体，感染Saos-2细胞，GFP荧光图片显示，感染效率在8()上。细胞功能学结果显示miR-376c过表达可显著抑制Saos-2细胞增殖能力和侵袭能力，当TGFA过表达后，可回复miR-376c对Saos-2细胞的功能学效应。
　　结论:
　　1、miR-376c与TGFA表达在骨肉瘤组织和细胞水平均成负相关关系。
　　2、miR-376c通过靶向结合TGFA3'-UTR上预测的miR-376c结合位点抑制TGFA蛋白的表达，且可抑制EGFR的表达。
　　3、miR-376c可抑制骨肉瘤细胞增殖和侵袭能力，TGFA过表达可回复该抑制效应。
　　4、miR-376c可通过靶向调控TGFA抑制骨肉瘤细胞的增殖与侵袭能力。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

前言

第一部分 靶向调控TGFA microRNA的预测及筛选

1．1 引言

1．2 实验材料

1．2．1 细胞

1．2．2 患者临床资料

1．2．3 主要仪器

1．2．4 主要试剂

1．3 实验方法

1．3．1 细胞培养

1．3．2 细胞的冻存、复苏和细胞计数

1．3．3 QPCR检测miRNAs和TGFA mRNA的表达

1．3．4 统计学分析

1．4 实验结果

1．4．1 TGFA靶miRNA的预测结果

1．4．2 组织标本中miR-376c的表达差异

1．4．3 组织标本中TGFA mRNA的表达差异

1．4．4 miR-376c和TGFA在正常骨骼肌组织与骨肉瘤组织中的表达相关性

1．4．5 骨肉瘤细胞中miR-376e的表达差异

1．4．6 骨肉瘤细胞中TGFA mRNA的表达差异

1．5 讨论

1．6 结论

第二部分 miR-376c靶向抑制TGFA的表达

2．1 引言

2．2 实验材料

2．2．1 试剂

2．2．2 主要设备

2．3 实验方法

2．3．1 QPCR

2．3．2 Western Blot

2．3．3 脂质体转染

2．3．4 双荧光素酶报告基因方法

2．3．5 统计学方法

2．4 实验结果

2．4．1 miR-376c mimics脂质体转染Saos-2细胞表达效率检测

2．4．2 过表达miR-376c对TGFA蛋白表达效率的影响

2．4．3 过表达miR-376e对EGFR蛋白表达效率的影响

2．4．4 转染TGFA ORF克隆对Saos-2细胞中TGFA蛋白表达的影响

2．4．5 过表达TGFA回复Saos-2细胞中TGFA蛋白表达水平

2．4．6 过表达TGFA回复Saos-2细胞中EGFR蛋白表达水平

2．4．7 双荧光素酶报告基因检测miR-376c靶向调控TGFA

2．5 讨论

2．6 结论

第三部分 miR-376c对骨肉瘤细胞增殖和侵袭能力的影响

3．1 引言

3．2 实验材科

3．2．1 试剂

3．2．2 细胞株

3．2．3 菌株

3．2．4 病毒载体

3．2．5 仪器

3．3 实验方法

3．3．1 pri-miR-376c表达载体的构建

3．3．2 miR-376c慢病毒包装

3．3．3 QPCR检测方法

3．3．4 Western blot检测方法

3．3．5 CCK-8检测方法

3．3．6 Transwell检测方法

3．3．7 统计学方法

3．4 实验结果

3．4．1 miR-376c慢病毒载体构建及鉴定

3．4．2 骨肉瘤Saos-2细胞慢病毒感染效率

3．4．3 miR-376c慢病毒感染骨肉瘤Saos-2细胞表达效率检测

3．4．4 miR-376c对骨肉瘤细胞Saos-2细胞生长曲线的影响

3．4．5 MiR-376c对骨肉瘤细胞Saos-2侵袭能力的影响

3．4．6 过表达TGFA回复miR-376c对Saos-2细胞增殖能力抑制的影响

3．4．7 过表达TGFA回复miR-376c对Saos-2细胞侵袭转移能力抑制的影响

3．5 讨论

3．6 结论

参考文献

综述 MicroRNA在骨肉瘤中的作用

攻读学位期间主要成果和获奖情况

致谢