DDAH2/ADMA通路在高糖诱导内皮祖细胞线粒体功能障碍中的作用及机制

摘要

研究背景:糖尿病血管病变是糖尿病致残致死最主要的原因之一，包括大血管病变（如高血压和动脉粥样硬化等）与微血管病变（如糖尿病视网膜病变和糖尿病肾病等）。血管内皮功能障碍和血管生成能力受损是导致糖尿病血管病变的重要因素。内皮祖细胞(Endothelialprogenitor cells，EPCs)是一类能循环、增殖并分化为成熟内皮细胞的前体细胞，其主要功能是修复内皮并促进血管新生。临床及动物实验显示糖尿病时，循环EPCs减少、血管形成能力减弱，提示EPCs功能改变可能在糖尿病血管病变发生发展中起重要作用。近年研究显示，线粒体功能障碍与糖尿病及糖尿病血管并发症密切相关。1型及2型糖尿病动物和患者伴有骨骼肌、肝脏、心脏、视网膜微血管和脂肪组织中线粒体氧化磷酸化活性下降，ATP生成减少，线粒体功能障碍。因此，调节线粒体功能可能是治疗糖尿病及血管并发症的重要药物靶点。EPCs线粒体功能障碍是否与糖尿病及血管并发症发生发展有关，目前尚未见报道。电压依赖性阴离子通道(voltage dependentanion channel，VDAC)是维持线粒体功能必不可少的通道蛋白，通过不同的结构或功能状态调节着线粒体内外的能量、离子及代谢产物的转运。研究表明，在1型、2型糖尿病动物以及糖尿病微血管病变动物，VDAC1表达均显著上调。基于EPCs在维持血管功能和促进血管修复中起重要作用、外周循环EPCs数目与糖尿病外周血管病变程度呈负相关，同时鉴于线粒体功能调节的关键蛋白VDAC1在糖尿病动物模型的高表达，本研究将在培养的EPCs，探讨高糖对EPCs线粒体功能的影响及其与VDAC1的关系，为阐明糖尿病及血管病变的发病机制提供新的实验证据。此外，我室和国内外研究表明，内源性一氧化氮合酶抑制物非对称二甲基精氨酸（asymmetricdimethylarginine，ADMA）升高在胰岛素抵抗、糖尿病以及糖尿病血管并发症中起重要作用。ADMA在体内主要经二甲基精氨酸-二甲胺水解酶（dimethylarginine dimethylaminohydrolase，DDAH）代谢。ADMA不仅可抑制人脐静脉内皮细胞增殖、迁移和血管形成，与链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠循环中EPCs数目下降和功能受损有关，且外源性ADMA能浓度依赖性促进EPCs的衰老，抑制其增殖和血管形成。新近研究报道，在1型和2型糖尿病大鼠，肝脏和心肌线粒体功能障碍与内源性ADMA浓度升高密切相关，并且外源性ADMA可直接引起大鼠肝细胞线粒体功能障碍，提示ADMA可能通过干扰EPCs线粒体功能，促进糖尿病及其血管并发症的发生发展。因此，本课题将在培养的大鼠EPCs，研究高糖对EPCs线粒体功能的影响，观察外源性ADMA是否可模拟高糖的损伤作用，并进一步探讨ADMA引起EPCs线粒体功能障碍是否涉及VDAC1途径。
　　方法:为了探讨高糖对EPCs线粒体功能的影响，葡萄糖(10、20或30 mmol/L)处理EPCs12、24或48小时，30 mmol/L甘露醇作为等渗对照组;为了观察DDAH/ADMA通路是否可模拟高糖诱导EPCs线粒体功能障碍的作用，外源性给予ADMA（3、10或30μmol/L）12、24或48小时;为了进一步探讨VDAC1在ADMA诱导EPCs线粒体功能障碍中的作用，预先用VDAC1抑制剂4，4'-二异硫氰酰-2，2'-基二磺酸二钠盐(4，4'-diisothiocyanatostilbene-2，2'dsulfonicacid，DIDS)(2，10，50μmol/L)孵育EPCs1小时后，再加入30μmol/L ADMA处理12小时。
　　密度梯度离心加选择性粘附分离正常大鼠骨髓EPCs，培养7天后acLDL/UEA-1双荧光染色鉴定;流式法检测线粒体膜电位，萤火虫荧光素酶法检测线粒体ATP生成;Hoechst法检测EPCs凋亡;Real-time PCR法检测DDAH1 mRNA、DDAH2 mRNA和VDAC1mRNA表达;细胞免疫荧光法鉴定VDAC1在EPCs的表达及定位;Western Blot法检测VDAC1蛋白表达;HPLC法检测细胞上清ADMA水平，荧光探针DCFH-DA法检测细胞内活性氧。
　　结果:高糖能浓度依赖性地抑制EPCs线粒体ATP生成，促进EPCs凋亡;高糖可显著增加细胞上清液ADMA水平，下调DDAH2mRNA表达，并上调VDAC1 mRNA和蛋白表达，但对DDAH1 mRNA表达无影响;甘露醇等渗组对EPCs功能没有影响。
　　外源性ADMA能显著上调VDAC1 mRNA和蛋白表达，增加细胞内活性氧生成，降低线粒体膜电位，抑制ATP生成，促进EPCs凋亡;VDAC抑制剂DIDS能显著抑制ADMA诱导的EPCs线粒体功能障碍、凋亡和细胞内活性氧生成。
　　结论:DDAH2/ADMA通路参与了高糖诱导的EPCs线粒体功能障碍，其作用机制可能涉及VDAC1途径。