紫杉醇/聚(2-乙基-2-恶唑啉)(PEtOz)和聚ε-己内酯(PCL)二嵌段共聚物微球的制备及药效学研究

摘要

紫杉醇(Paclitaxel，商品名Taxol)，是从红豆杉属植物中提取出来的一种具有高效抗肿瘤活性的天然物质。它是一种新型的微管稳定剂，具有独特抗癌活性。自1992年12月美国食品药品管理局(FDA)批准紫杉醇用于治疗晚期卵巢癌以来，其在临床上的应用范围逐渐扩展，并从二线药物变成一线用药，可以说是目前最好的抗癌药物之一。
　　紫杉醇是一种天然的三环二萜物质，有一个庞大繁杂的环状结构及众多的疏水性取代基，因而在水中的溶解性很差。临床应用的主要是紫杉醇注射液，即由乳浮EL(Crem0ph0r EL，含聚氧乙烯蓖麻油)/无水乙醇(50∶50)制成的无色黏稠状浓溶液。这种传统剂型设计的目的是为了改善紫杉醇的水溶性。但大量研究显示聚氧乙烯蓖麻油在体内可促使大量组织胺释放，产生过敏反应，而且还可溶解聚氯乙烯(PVC)输液器中的二乙烯己基邻苯二甲酸盐，带来严重的毒性反应，大大影响紫杉醇的临床安全应用。
　　基于上述原因，国内外众多科学家对紫杉醇的剂型改造进行了大量研究。本研究设计了一种两亲型嵌段共聚物，其亲水段为聚(2-乙基-2-恶唑啉)(PEtOz)，在人体内不会产生毒、副作用，无免疫源性，而疏水段为可生物降解的聚ε-己内酯(PCL)，其降解产物为内源性物质谷氨酸，在体内不易产生蓄积和毒副作用，因此利用两组分形成的嵌段共聚物(PetOz-PCL)具亲水和疏水性为一体，在水溶液中可自组装形成球形核-壳结构的微球系统，其中疏水嵌段构成内核并作为微药库通过化学键合或物理包埋的方式结合紫杉醇，极大地增加紫杉醇的水溶性，释药具有突释阶段和缓释作用。同时亲水嵌段聚(2-乙基-2-恶唑啉)作为微球的外核，使纳米胶束躲避体内免疫系统的层层监视，降低被肝脾肺中网状内皮系统(RES)摄取，延长胶束在血液中循环时间。
　　围绕上述目的，本文主要研究了以下几方面的内容。
　　(1)聚(2-乙基-2-恶唑啉)(PEtOz)和聚ε-己内酯(PCL)(PetOz-PCL)嵌段共聚物的合成与表征。
　　以聚(2-乙基-2-恶唑啉)和聚ε-己内酯为原料，合成了一系列组成的PetOz-PCL嵌段共聚物，利用IR、1H-NMR对聚合物的结构进行了表征。结果表明，经阴离子聚合可以生成PetOz-PCL嵌段共聚物，其中PetOz嵌段的优势构象为a螺旋构象。
　　(2)聚(2-乙基-2-恶唑啉)(PEtOz)和聚ε-己内酯(PCL)微球的自组装。
　　用膜透析法等不同方法制备聚(2-乙基-2-恶唑啉)(PEtOz)和聚ε-己内酯(PCL)两亲嵌段共聚物的微球，考察其粒径变化。用液相(HPLC)、紫外分光光度计(UV)验证PetOz-PCL微球溶性的不同药物包埋，用HPLC、UV测定了微球药量和包封率。结果表明，PetOz-PCL微球能埋疏水性药物，其载药量与载体的嵌段比有很大关系，疏水嵌段过大或过小都会引起微球不稳定，载药量下降;载药量随投药量的增加而增加，但超过微球包埋能力后，其包封率很快降低。
　　(3)聚(2-乙基-2-恶唑啉)(PEtOz)和聚ε-己内酯(PCL)微球的细胞毒性试验。
　　采用溶血法比较，研究在不同浓度下聚(2-乙基-2-恶唑啉)(PEtOz)和聚ε-己内酯(PCL)微球，与紫杉醇注射剂中增溶剂聚氧乙烯化蓖麻油的体外红细胞溶血毒性。结果表明:在浓度高于0.125 mg/ml时随着浓度的增加，由吐温80引起的溶血反应也不断增加;而PetOz-PCL共聚物浓度在10 mg/ml时引起的溶血反应相当低，而这一浓度的吐温80引起的溶血反应达到82.8％。另一方面，PetOz-PCL共聚物引起的溶血反应在0.3％-2.7％之间，与蓖麻油引起的溶血反应类似。
　　(4)紫杉醇/聚(2-乙基-2-恶唑啉)(PEtOz)和聚ε-己内酯(PCL)微球体外药效试验。
　　在不同紫杉醇药物浓度下，采用MTT法比较了紫杉醇/聚(2-乙基-2-恶唑啉)(PEtOz)和聚ε-己内酯(PCL)微球与临床使用的紫杉醇注射剂对癌细胞疗效。结果表明，当含紫杉醇浓度高于30μM/ml时，因溶液为饱和紫杉醇浓度，对癌细胞的抑制杀灭效果是一样的。各个实验组细胞毒性评分均为4，表现明显的细胞毒性:低于30μM/ml。紫杉醇/聚(2-乙基-2-恶唑啉)(PEtOz)和聚ε-己内酯(PCL)微球包裹的药物全部释放，杀灭癌细胞疗效要远高于具有增溶剂毒性的紫杉醇注射剂(P＜0.01）。
　　(5)紫杉醇/聚(2-乙基-2-恶唑啉)(PEtOz)和聚ε-己内酯(PCL)微球的药效学实验。
　　采用肿瘤瘤块皮下移植法建立了人表皮癌KB细胞裸鼠移植模型，对比观察了紫杉醇/聚(2-乙基-2-恶唑啉)(PEtOz)和聚ε-己内酯(PCL)微球与紫杉醇注射剂对裸鼠表皮癌模型的疗效。结果表明，裸鼠皮下移植瘤块可成功建立了人表皮癌裸鼠移植模型。紫杉醇/聚(2-乙基-2-恶唑啉）(PEtOz)和聚ε-己内酯(PCL)微球对裸鼠的肿瘤生长具有明显抑制作用。紫杉醇/聚(2-乙基-2-恶唑啉)(PEtOz)和聚ε-己内酯(PCL)微球组治疗肿瘤疗效高于紫杉醇注射剂组(P＜0.01)，而制剂毒性明显低于紫杉醇注射剂组。
　　综上所述，本研究制备了基于两亲共聚物聚(2-乙基-2-恶唑啉)(PEtOz)和聚ε-己内酯(PCL)的二嵌段共聚物微球PetOz-PCL。同时使用透析法成功将紫杉醇装载至二嵌段共聚物微球PetOz-PCL。装载紫杉醇的二嵌段共聚物微球粒径在19.4至23.4nm间。嵌段共聚物中疏水共聚物含量越多，紫杉醇包封率越高。溶血试验表明，二嵌段共聚物微球PetOz-PCL作为一种注射用载体比吐温80更加安全，它所表现出的细胞膜毒性与蓖麻油差不多。体外MTT实验同时表明，紫杉醇整合至二嵌段共聚物微球后，仍然保留了对KB细胞增殖的抑制活性，和相同浓度的基于蓖麻油溶解的紫杉醇比较，整合至二嵌段共聚物微球的紫杉醇抑制活性更高。紫杉醇包封率及载药量的评价、细胞膜毒性评估及对癌细胞增殖抑制活性的检测都证实了二嵌段共聚物微球PetOz-PCL是一种性能良好的紫杉醇载体。