非肌肉型肌球蛋白调节轻链在大鼠脑缺血/再灌注损伤中的作用及机制

摘要

1、背景和目的:脑在缺血一定时间并恢复血液灌流后，损伤出现加重的矛盾现象，称为脑缺血/再灌注损伤(cerebral ischemiareperfusion injury, CI/R)。脑缺血/再灌注损伤涉及多种机制，氧化应激是其中重要机制之一。
　　氧化应激是指机体活性氧(ROS)产生过多和/或抗氧化能力降低，使得ROS在细胞内大量蓄积而引起的组织细胞氧化损伤过程。机体内生成ROS的酶系很多，而NADPH氧化酶(NOX)来源的ROS在心血管系统疾病中的作用最受关注。
　　脑缺血/再灌注损伤时，NOX的活性和表达会有显著升高，伴随ROS水平上升和脑组织损伤。目前虽然有文献报道NOX来源的ROS在脑缺血/再灌注氧化损伤中发挥重要作用，但对NOX各亚型表达情况尚缺乏系统全面的研究，对脑缺血/再灌注时NOX表达变化机制则知之甚少。
　　非肌肉型肌球蛋白轻链(non-muscle myosin light chain，MLC20)是非肌肉型肌球蛋白Ⅱ的组成部分，MLC20的磷酸化水平受肌球蛋白轻链激酶(MLCK)调节。MLC20磷酸化水平的改变涉及到多种疾病（包括脑卒中）的发生发展。有研究表明MLC20磷酸化水平升高可能与脑缺血损伤密切相关，但机制不详。
　　已有文献报道，人肺内皮细胞的MLCK通过磷酸化MLC20调节NOX的激活和ROS的产生，如前所述，NOX在介导脑缺血/再灌注氧化损伤中发挥重要作用，我们的预实验也证实了这一点，这一现象是否与MLC20磷酸化水平变化有关？
　　基于文献报道和预实验结果，我们推测脑缺血/再灌注时MLC20可能通过其蛋白磷酸化水平变化参与了NOX活性和/或表达调节。
　　2、方法:采用脑中动脉阻断(MCAO)法构建大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，雄性SD大鼠(250～300g)70只，随机分为7组，每组10只:①正常对照组（Control组）;②假手术组（Sham组）;③脑缺血再灌注组（CI/R组）;④MLCK特异性抑制剂ML-7+脑缺血再灌注组（CI/R+ML-7组）;⑤NOX抑制剂DPI+脑缺血再灌注组（DPI+CI/R组）;⑥NOX抑制剂apocynin+脑缺血再灌注组（apocynin+CI/R组）;⑦溶媒+脑缺血再灌注组（CI/R+溶媒组）。采用Bederson评分法对大鼠神经学功能进行评分，HE染色观察病理组织形态学特点，TTC染色观察并计算梗死灶体积，DNA缺口末端原位标记（TUNEL）染色观察细胞凋亡。收集各组动物脑组织，比色法测定脑中H2O2的含量、NOX、caspase-3活性，ELISA法测脑组织中MLCK的活性。收集脑组织并提取RNA和蛋白，测定NOX1-4的mRNA表达，NOX1、2、4及p-MLC20的蛋白表达。
　　3、结果:(1)与对照组相比，脑缺血/再灌注组大鼠死亡率显著升高，并伴随明显的神经学功能缺陷和脑梗死灶，这些现象均可被ML-7、DPI或apocynin显著减轻;
　　(2)与对照组相比，脑缺血/再灌注组大鼠脑组织水肿，有空泡形成，核固缩溶解，核仁消失，神经元间隙扩大，排列失去正常规则。给予ML-7、DPI或apocynin处理后，神经元损伤明显减轻，损伤神经元数量减少，缺血区域存活神经元增多，边界及核仁清楚，只有部分细胞出现胞核萎缩，胞浆消失。
　　(3)对比正常对照组，TUNEL阳性细胞数和caspase-3活性在缺血/再灌注组大鼠脑组织中显著增加，ML-7、DPI或apocynin干预组，凋亡细胞数和caspase-3活性显著下降。
　　(4)与正常组相比，脑缺血/再灌注组大鼠脑组织中NOX2，NOX4的mRNA及蛋白表达水平明显上调，H2O2含量和NOX活性显著增加，这些变化均可被ML-7、DPI或apocynin减弱;
　　(5)与正常组相比，缺血/再灌注组大鼠脑组织MLCK活性显著升高，伴随总蛋白和核蛋白中MLC20蛋白磷酸化水平显著上调，这些现象可被MLCK抑制剂ML-7减弱，但不受NOX抑制剂的影响。
　　4、结论:脑缺血/再灌注时，NOX2和NOX4基因表达上调和NADPH氧化酶活性升高是导致缺血/再灌注氧化应激损伤的重要原因。脑缺血/再灌注时MLC20通过蛋白磷酸化水平变化参与了NOX2和NOX4基因的表达调节。