亲代大鼠神经病理性疼痛对子代情绪行为学的影响及与杏仁核DNA甲基化的关系

摘要

目的：
　　观察神经病理性疼痛大鼠对其F1代的基础痛阈、焦虑抑郁等负面情绪的影响，以及通过交叉喂养的方式弄清这种影响与母鼠母爱行为的关系，并初步阐释神经病理性疼痛的代间影响与杏仁核DNA甲基化的关系。
　　方法：
　　1、健康成年SD大鼠，雌雄各12只，随机分为四组:CCI雄性（C1组，n=6）、CCI雌性（C2组，n=6）、假手术雄性（S1组，n=6）、假手术雌性（S2组， n=6）。其中C1、C2组左侧后肢行CCI模型，假手术组仅暴露出左后肢坐骨神经，但不结扎。四组大鼠在模型制作后10d检测其机械痛阈、热痛阈、高架十字迷宫和旷场实验检测其焦虑和抑郁情绪，然后进行交叉配对分为四组，每组3对，每组母鼠分娩的F1代大鼠按其父母来源命名为:FC1C2组、FC1S2组、FS1C2组和FS1S2组。每组F1代大鼠由各自母亲喂养至21d后断奶，并单独饲养至30d后测定机械性痛阈、热痛阈、焦虑、抑郁情绪、福尔马林实验检测其炎性痛特点，在所有的行为学结束后，深麻醉下处死，从心尖取血，ELISA法测定血清内CRH和COR浓度。
　　2、健康成年SD大鼠，雌雄各24只，随机分为四组:CCI雄性（C1组，n=12）、CCI雌性（C2组，n=12）、假手术雄性(S1组，n=12)、假手术雌性（S2组，n=12）。其中C1、C2组左侧后肢行CCI模型，假手术组仅暴露出左后肢坐骨神经，但不结扎。四组大鼠在模型制作后10d进行交叉配对分为四组，每组6对，每只母鼠确定受孕后单笼饲养，在其分娩后即刻将C2组和S2组所生的F1代随机各分为2小组，即共分为:FC2组、FC2，组、FS2组和FS2，组四组，其中FS2，组与FC2，组F1代大鼠在出生后即互换喂养，而FC2组和FS2组仍由原母亲喂养。然后分别检测四组母鼠回收和舔舐仔鼠的母爱行为。所有F1代大鼠由选定的母亲喂养至21d后断奶，单独饲养至1月后检测机械性痛阈、热痛阈、焦虑和抑郁情绪，行为学检测结束后，将所有仔鼠处死，免疫组化检测下丘脑视上核催产素的表达。
　　3、健康成年SD大鼠，雌雄各24只，随机分为四组:CCI雄性（C1组， n=12）、CCI雌性(C2组， n=12)、假手术雄性(S1组，n=12)、假手术雌性(S2组，n=12)。四组大鼠在模型制作后10d进行交叉配对分为四组，每组6对，四组大鼠分娩后将其子代分为FC2组、FC2，组、FS2组和FS2，组四组，其中FS2，组与FC2，组F1代大鼠在出生后即互换喂养，而FC2组和FS2组仍由原母亲喂养。F1代大鼠生后30d时，每组随机分为2小组，其中1组用多聚甲醛灌注取脑，免疫组化检测杏仁核DNMT1、DNMT3a/b，另外1组深麻醉下处死后在冰上迅速取出杏仁核，western blot检测DNMT1、DNMT3a/b蛋白表达，DNA甲基化试剂盒检测杏仁核总体甲基化水平。
　　结果：
　　1、亲代大鼠中，C1、C2组的机械性痛阈和热痛阈，开放臂停留时间/闭合臂停留时间（高架十字迷宫）和中央格停留时间/周围格停留时间（旷场实验）均明显低于S1、S2组，而C1与C2，S1与S2组间比较无差异。子代大鼠，母亲为神经病理性疼痛的FC1C2、FS1C2组其开放臂（中央格）停留时间/闭合臂（周围格）停留时间明显低于母亲为正常大鼠的FC1S2和FS1S2组，而四组子代大鼠的基础机械及热痛阈无明显差异;福尔马林实验中，FC1C2、 FS1C2组在Ⅱ相痛觉评分明显高于FC1S2、FS1S2组，Ⅰ相痛觉评分四组间无差异;血清CRH和COR的浓度，FC1C2、FS1C2组明显高于FC1S2、FS1S2组。子代的这些结果与父亲的疼痛状态无关。
　　2、亲代大鼠中，患有神经病理性疼痛的C2、C2'组其收集和舔舐幼仔的潜伏期及收集的总时间明显长于正常的S2、S2'组，而舔仔的总时间却明显低于正常大鼠。在子代，所有子代大鼠的基础机械及热痛阈相近，而神经病理性疼痛母亲喂养的FC2、FS2，组开放臂（中央格）停留时间/闭合臂（周围格）停留时间比值明显低于正常大鼠喂养的FC2，和FS2组，下丘脑视上核的催产素表达FC2、FS2，也明显低于FC2，和FS2组。
　　3、在子代大鼠中，免疫组化和western blot结果均显示FC2、FS2，组杏仁核内DNMT1蛋白表达明显高于FC2，、 FS2组，DNMT3a/b四组间无差异;杏仁核内DNA总体甲基化程度FC2、FS2，组也较FC2，、FS2两组高，这些指标在FC2和FS2，组，FC2，和FS2组间无差异。
　　结论：
　　1、母亲而非父亲发生神经病理性疼痛后虽然对子代的基础痛阈无影响，但会使子代产生焦虑抑郁等负面情绪，使子代对新发生的疼痛感知更敏感，且使子代HPA轴处于活跃状态。
　　2、神经病理性疼痛母代对子代的影响与遗传因素和孕期经历无关，可能是因为母爱行为的减少造成的，且这种对子代照顾行为的减弱可能会在代间继续传递。
　　3、神经病理性疼痛母代对子代影响的分子机制可能与杏仁核甲基化程度相关，且这一结果可能是通过DNMT1而非DNMT3a/b介导的。

目录

声明

摘要

缩略词简表

前言

第1章 神经病理性疼痛大鼠对F1代疼痛相关行为学的影响

1．1 材料

1．1．1 实验动物

1．1．2 主要实验仪器及试剂

1．2 方法

1．2．1 实验动物分组

1．2．2 大鼠左后肢CCI模型制作

1．2．3 大鼠配对

1．2．4 机械性痛阈测定

1．2．5 热痛阈测定

1．2．6 高架十字迷宫实验(High plus maze test)

1．2．7 旷场实验(open-field test)

1．2．8 福尔马林实验

1．2．9 子代大鼠血标本的抽取

1．2．10 ELISA法检测血清中CRH、COR

1．2．11 数据处理与统计学分析

1．3 结果

1．3．1 实验动物一般情况

1．3．2 四组亲代大鼠模型制作10d后机械痛阈及热痛阈的比较

1．3．3 四组亲代大鼠模型制作10d后焦虑抑郁情绪的比较

1．3．4 四组F1代大鼠生后30d机械痛阈和热痛阈的比较

1．3．5 四组F1代大鼠生后30d焦虑抑郁情绪的比较

1．3．6 四组F1代大鼠生后30d左后足福尔马林实验比较

1．3．7 四组F1代大鼠生后30d血内CRH、COR的比较

1．4 讨论

1．4．1 慢性疼痛与情绪反应

1．4．2 慢性疼痛与内分泌免疫系统

1．4．3 小结

第2章 神经病理性疼痛大鼠母爱行为的改变及对子代痛行为的影响

2．1 材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 主要实验仪器及设备

2．1．3 主要实验试剂

2．2 方法

2．2．1 实验动物分组

2．2．2 亲代大鼠母爱行为检测

2．2．3 子代大鼠机械性痛阈检测

2．2．4 子代大鼠热痛阈检测

2．2．5 子代大鼠高架十字迷宫实验

2．2．6 子代大鼠旷场实验

2．2．7 心尖灌注及脑标本获取和处理

2．2．8 冰冻切片取下丘脑视上核区脑片

2．2．9 免疫组织化学检测视上核OT表达

2．2．10 数据处理和统计分析

2．3 结果

2．3．1 四组亲代母鼠母爱行为的比较

2．3．2 四组子代大鼠基础痛阈的比较

2．3．3 四组子代大鼠焦虑抑郁情绪反应的比较

2．3．4 四组子代大鼠视上核OT表达差异

2．4 讨论

2．4．1 孕期不良事件对子鼠神经系统发育和成年后行为改变的影响

2．4．2 出生后母爱对大鼠行为的影响

2．4．3 小结

第3章 神经病理性疼痛对子代杏仁核甲基化的影响

3．1 材料

3．1．1 实验动物

3．1．2 主要实验仪器及设备

3．1．3 主要实验试剂

3．1．4 主要试剂配制

3．2 方法

3．2．1 动物分组

3．2．2 子代大鼠灌注取脑及免疫组化

3．2．3 子代大鼠杏仁核标本的获得

3．2．4 western blot检测杏仁核DNMT1、DNMT3a／b

3．2．5 杏仁核总体DNA的提取

3．2．6 杏仁核内总DNA甲基化的测定

3．2．7 数据处理及统计分析

3．3 结果

3．3．1 四组子代大鼠杏仁核DNMT1免疫组化

3．3．2 四组子代大鼠杏仁核内DNMT3a／b的免疫组化

3．3．3 四组子代大鼠杏仁核内DNMT1、DNMT3a／b的western blot结果

3．3．4 四组子代大鼠杏仁核内DNA总体甲基化

3．4 讨论

3．4．1 杏仁核在慢性疼痛中的作用

3．4．2 表观遗传学与慢性疼痛

3．4．3 小结

参考文献

综述 表观遗传学在疼痛中的研究进展

攻读博士学位期间主要研究成果

致谢