香烟提取物所致小鼠肺气肿模型骨髓内皮祖细胞C-Kit/可溶性干细胞因子交互作用受损及其机制研究

摘要

背景:肺微血管内皮损伤和细胞凋亡是COPD/肺气肿发病的重要机制之一。目前认为损伤内皮的修复主要机制是在各种促内皮修复和血管发生因子作用下局部血管内皮细胞和循环内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)定向迁移和增殖的过程。烟草烟雾暴露引起外周血中EPCs数量减少。因为骨髓EPCs动员能力影响外周血中EPCs数量，我们推测在烟草烟雾暴露的引起的COPD/肺气肿发病过程中可能存在有与骨髓EPCs动员相关的c-Kit/可溶性干细胞因子(soluble stem cell factor, s-SCF)相互作用减弱的现象。
　　目的:本研究利用腹腔注射香烟提取物(Cigarette Smoking Extract，CSE)构建小鼠肺气肿模型，观察经腹腔暴露CSE诱导的肺气肿小鼠骨髓中EPCs动员相关的c-Kit/s-SCF交互作用水平(即骨髓c-Kit(+)EPCs数量和s-SCF浓度）是否存在变化;如果证实骨髓c-Kit(+)EPCs数量和s-SCF存在变化，我们将进一步研究这些变化所涉及的相关机制。
　　方法:1.香烟提取物所致小鼠肺气肿模型中骨髓c-Kit+内皮祖细胞和可溶性干细胞因子变化:24只4～6周龄的雄性C57BL/6J小鼠随机分为正常对照组及CSE（每组12只），分别在实验第0、11及22天定时定量腹腔注射CSE溶液/PBS溶液，第7天收集骨髓标本（每组6只），第28天测定小鼠气道阻力和动态肺顺应性后收集肺组织标本和骨髓标本。肺组织病理切片苏木素-伊红（HE）染色后观察形态学改变并定量测定平均肺泡隔厚度(MAST)、平均内衬间隔(MLI)及肺泡破坏指数(DI)。免疫印迹和实时定量PCR测定小鼠肺组织c-Kit蛋白和mRNA表达。骨髓细胞经红细胞裂解后经流式细胞仪测定EPCs和c-Kit(+)EPCs水平，ELISA测定骨髓冲洗液上清液s-SCF浓度。
　　2.香烟提取物所致小鼠肺气肿模型中可溶性干细胞因子减少机制初探:明胶酶谱法测定小鼠骨髓冲洗液上清MMP-9活性，化学法测定小鼠骨髓冲洗液上清NO浓度，ELISA法测定小鼠骨髓冲洗液上清MMP-9和TIMP-1浓度。免疫印迹法测定小鼠骨髓细胞SCF、MMP-9、TIMP-1和NOS3蛋白水平。实时定量PCR测定小鼠骨髓组织SCF及MMP-9mRNA表达。
　　3.香烟提取物对体外培养的骨髓内皮祖细胞增殖和凋亡及其c-Kit+细胞亚群构成的影响:采用密度梯度离心法分离小鼠骨髓EPCs并培养;通过观察细胞形态学改变、对培养第7天的贴壁细胞行DiI-acLDL摄取及FITC-UEA-I结合双染鉴定及流式细胞术检测细胞表面标志物，综合鉴定EPCs。分别以0.5％、1％及2％CSE干预培养7天的小鼠EPCs，采用噻唑蓝比色法(MTT法)检测EPCs增殖能力，采用AnnexinⅤ-FICT/PI双染法检测EPCs凋亡。测定1％CSE对培养7天的小鼠的EPCs NO分泌及NOS3表达的影响，测定1％CSE对培养7天的小鼠EPCs c-Kit表达和c-Kit亚群的影响。
　　结果:1.香烟提取物所致小鼠肺气肿模型中骨髓c-Kit+内皮祖细胞和可溶性干细胞因子变化:实验第28天，模型组和对照组的Raw和 Cdyn分别是(2.15±0.27) cmH2O/ml·sec vs(1.13±0.09)cmH2O/ml·sec,(32.65±2.87)μL/cmH2O vs(52.51±1.90)μL/cmH2O，P均＜0.05。与对照组相比，模型组肺实质破坏明显、肺泡壁变薄、部分肺泡破裂和肺泡腔扩大，肺气肿形成;模型组平均内衬间隔(MLI)和肺泡破坏指数(DI)显著增高，而平均肺泡隔厚度(MAST)显著降低，P均＜0.05。对照组和模型组的肺组织c-Kit蛋白相对表达分别是(0.59±0.090) vs(0.39±0.09)，P＜0.05。模型组和对照组肺组织c-Kit mRNA相对表达分别为(0.07±0.01) vs(0.10±0.02)，模型组肺是对照组的-1.43倍，P＜0.05。对照组与模型组第28天的右胫骨骨髓经红细胞裂解后的非红细胞数分别是(9.44×106)±(1.82×106)vs(9.03×106)±(1.72×106)，P＞0.05; EPCs和c-Kit(+)EPCs分别占非红细胞的(6.92±1.35)％vs(3.99±0.49)％，(4.73±0.63)％vs(3.09±0.37)％，P均＜0.05;对照组和模型组第7天和第28天骨髓冲洗液上清液s-SCF浓度分别是(36.83±7.86) pg/mL vs(27.52±6.30) pg/mL、(32.59±8.97) pg/mL vs(14.67±1.18) pg/mL，P均＜0.05。
　　2.香烟提取物所致小鼠肺气肿模型中可溶性干细胞因子减少机制初探:尽管模型组小鼠骨髓冲洗液上清液MMP-9活性第7天无明显变化(P＞0.05)，但是第28天活性显著降低(P＜0.05);对照组和模型组第7天和第28天小鼠骨髓冲洗液上清液NO浓度分别是(7.34±1.41)μmol/mL vs(10.34±3.52)μmol/mL(P＜0.05)、(7.96±1.19)μmol/mL vs(6.86±1.37)μmol/mL(P＞0.05);对照组与模型组第7天和第28天小鼠骨髓冲洗液上清液MMP-9浓度分别是(4.93±0.57)ng/mL vs(7.62±1.41)ng/mL(P＜0.005)、(5.36±0.68)ng/mL vs(4.99±0.62)ng/mL(P＞0.05);对照组与模型组第7天和第28天小鼠骨髓冲洗液上清液TIMP-1浓度分别是(335.77±66.12)pg/mL vs(527.96±82.01)pg/mL、(322.67±54.31)pg/mLvs(597.54±90.57)pg/mL，P均＜0.01;对照组与模型组第7天和第28天小鼠骨髓冲洗液上清液中MMP-9/TIMP-1分别是(14.81±3.74) vs(15.09±2.95)(P＞0.05)，(17.18±4.69) vs(8.59±2.23)(P＜0.005);对照组与模型组小鼠第7天骨髓细胞SCF、MMP-9、TIMP-1及NOS3蛋白相对表达分别是(0.73±0.08) vs(0.41±0.07)、(0.53±0.11) vs(0.80±0.15)、(0.52±0.09) vs(0.79±0.12)及(0.61±0.07) vs(0.73±0.05)，P均＜0.05;对照组与模型组小鼠第28天骨髓细胞SCF、MMP-9、TIMP-1及NOS3蛋白相对表达分别是(0.75±0.09)vs(0.39±0.17)(P＜0.05)、(0.59±0.10)和(0.57±0.13)(P＞0.05)、(0.54±0.05) vs(0.83±0.09)(P＜0.05)、(0.60±0.06) vs(0.26±0.03)(P＜0.05);对照组与模型组7天和第28天小鼠骨髓细胞SCF mRNA相对表达分别是[(6.58×10-4)±(2.51×10-4)] vs[(3.13×10-4)±(1.76×10-4)]和[(6.46×10-4)±(2.50×10-4)] vs[(3.29×10-4)±(2.02×10-4)]，P均＜0.05;对照组与模型组7天和第28天小鼠骨髓细胞MMP-9mRNA相对表达分别是(0.13±0.02) vs(0.20±0.06)(P＜0.05)、(0.14±0.04) vs(0.14±0.03)(P＞0.05)。
　　3.香烟提取物对体外培养的骨髓内皮祖细胞增殖和凋亡及其c-Kit+细胞亚群构成的影响:培养7天的小鼠EPCs呈梭形、纺锤形或多边形，可形成首尾相连网状血管样结构，亦可呈铺路石样外观，其DiI-acLDL摄取及FITC-UEA-I结合双染阳性率为(94.67±4.16)％，其特异性表面抗原CD34+CD133+Flk-1+细胞占（95.07±1.73）％;0％、0.5％ CSE、1％ CSE及2％ CSE干预培养的EPCs后，MTT法测定的OD450分别是(0.197±0.014)、(0.138±0.007)、(0.106±0.007)及(0.047±0.006)，AnnexinⅤ-FICT/PI双染法测定的凋亡率分别是(16.754±1.396)％、(39.660±2.906)％、(52.320±3.372)％及(74.313±6.522)％，P均＜0.01。对照组和1％ CSE干预组EPCs培养上清液NO浓度分别是(38.89±4.27)umol/L vs(13.47±2.18)umol/L，P＜0.005;对照组和1％ CSE干预组培养细胞中c-Kit+亚群分别为(48.30±3.82) vs(50.29±3.45)，P＞0.05;对照组和1％ CSE干预组培养细胞中NOS3和c-Kit蛋白的相对表达分别是(0.614±0.060) vs(0.235±0.049)及(0.709±0.018) vs(0.376±0.053)，P均＜0.005。
　　结论:1.在腹腔注射CSE所致的小鼠肺气肿中骨髓EPCs动员依赖的c-Kit/s-SCF交互作用受损。
　　2.骨髓SCF蛋白和mRNA表达下调及MMP-9酶活性降低促成骨髓s-SCF浓度降低，骨髓MMP-9活性降低与MMP-9/TIMP-1失平衡有关。
　　3.经CSE体外干预24小时，小鼠骨髓EPCs增殖能力下降、凋亡增加，并呈浓度依赖性;CSE负性调节小鼠骨髓EPCs中与细胞增殖和生存相关的信号——c-Kit和NOS3/NO。

目录

论文说明

声明

摘要

符号说明

1．前言

1．1 引言

1．2 COPD的发病机制及病理变化

1．3 烟草烟雾暴露诱导肺气肿的形成机制

1．4 炎症、蛋白酶／抗蛋白酶失衡、氧化应激与肺泡细胞凋亡

1．5 内皮细胞凋亡与肺气肿

．1．6 内皮祖细胞

1．7 COPD与内皮祖细胞

1．8 香烟烟雾暴露与EPCs

1．9 假说

2．香烟提取物所致小鼠肺气肿模型中骨髓c-Kit+内皮祖细胞和可溶性干细胞因子变化

2．1 材料与方法

2．1．1 材料与主要试剂、仪器

2．1．2 实验方法

2．1．3 统计学分析

1．2 实验结果

2．2．1 腹腔注射CSE后小鼠行为学观察

2．2．2 小鼠肺功能结果分析

1．2．3 小鼠肺组织病理形态学分析

2．2．4 小鼠肺组织c-Kit蛋白和mRNA表达

2．2．5 小鼠骨髓细胞中EPCs水平

2．2．6 小鼠骨髓可溶性干细胞因子浓度

2．3 讨论

2．3．1 肺气肿小鼠模型的鉴定

2．3．2 肺气肿小鼠模型中肺组织c-Kit表达降低

2．3．3 肺气肿小鼠中骨髓EPCs动员依赖的c-Kit与s-SCF交互作用受影响

2．4 结论

3．香烟提取物所致小鼠肺气肿模型中可溶性干细胞因子减少机制初探

3．1 材料与方法

3．1．1 材料与主要试剂、仪器

3．1．2 实验方法

3．1．3 统计学分析

3．2 实验结果

3．2．1 肺气肿小鼠骨髓冲洗液MMP-9活性降低

3．2．2 肺气肿小鼠骨髓冲洗液NO浓度变化

3．2．3 肺气肿小鼠骨髓冲洗液MMP-9／TIMP-1失平衡

3．2．4 肺气肿小鼠骨髓细胞SCF、MMP-9、TIMP-1及NOS3蛋白表达变化

3．2．5 肺气肿小鼠骨髓细胞SCF mRNA表达减少

3．3 讨论

3．4 结论

4．香烟提取物对体外培养的骨髓内皮祖细胞增殖和凋亡及其c-Kit+细胞亚群构成的影响

4．1 材料与方法

4．1．1 材料与主要试剂、仪器

4．1．2 实验方法

4．1．3 统计学分析

4．2 实验结果

4．2．1 密度梯度离心法培养EPCs的鉴定

4．2．2 CSE干预EPCs 24小时后细胞增殖和凋亡的变化

4．2．3 1％CSE干预EPCs 24小时后EPCs合成NO减少

4．2．4 1％CSE干预EPCs 24小时后c-kit+细胞亚群所占比例无变化

4．2．5 1％CSE干预EPCs 24小时后EPCs中NOS3和c-Kit表达减少

4．3 讨论

4．4 结论

5．全文总结

参考文献

综述 内皮祖细胞与呼吸系统疾病

攻读博士学位期间发表的论文

致谢