预适应联合后适应对大鼠脑缺血/再灌注损伤保护作用及机制研究

摘要

目的:
　　观察缺血预适应、缺血后适应以及两者联合应用对大鼠脑缺血/再灌注损伤的保护作用，对大鼠脑缺血/再灌注损伤后缺血脑组织中HSP70蛋白、不同亚型HSP70基因表达以及磷脂酰肌醇-3-激酶/Akt(PI3K/Akt)、细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)信号通路活性的影响。
　　方法:
　　120只SD大鼠随机分为5组:假手术组、脑缺血/再灌注损伤模型组、预适应组、后适应组以及预适应+后适应组。除假手术组大鼠外，其余各组均用线栓法闭塞大脑中动脉120 min后再灌注48 h，制作脑缺血/再灌注损伤模型;预适应在造模24和1h前采用3个循环的缺血15 s/再灌注30 s的方法诱导;后适应于再灌注前采用3个循环的再灌注30 s/缺血15s的方法诱导。再灌注48 h后，分别检测大鼠神经功能、脑梗死灶体积、脑组织氧化应激损伤生化指标以及神经元凋亡情况。50只大鼠随机分为5组，再灌注48 h后，分别用法免疫组化检测HSP70蛋白的表达;用Real-time PCR检测HSPA8、HSPA1A及HSPA12B基因表达;用Western Blot检测磷酸化Akt（p-Akt）和磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)蛋白表达。
　　结果:
　　与模型组比较，预适应与后适应均能明显改善大鼠脑缺血/再灌注损伤后的神经功能和减少脑梗死灶体积，两者保护作用强度相似，无明显差异，预适应联合后适应改善大鼠脑缺血/再灌注损伤后的神经功能和减少脑梗死灶体积的作用明显强于单独的预适应或后适应。脑缺血/再灌注后，大鼠脑组织超氧化物歧化酶(SOD)活性降低和丙二醛(MDA)含量增高，预适应略有升高SOD活性和降低MDA含量的作用，而后适应能显著升高脑组织中SOD活性和降低MDA含量，预适应联合后适应后，升高脑组织SOD活性、降低MDA含量的作用进一步增加，明显强于单独的预适应或后适应。与模型组比较，预适应和后适应均能减少缺血区脑组织的神经细胞凋亡数量，而后适应减少神经细胞凋亡数量的作用强于预适应，两者联合应用较少脑缺血/再灌注损伤后神经元凋亡的作用增强。假手术组脑组织HSP70呈微量表达，与假手术组比较，脑缺血/再灌注损伤模型组脑组织HSP70呈轻度表达，而预适应和后适应组HSP70阳性细胞明显增多，呈中度表达，预适应+后适应组可见大量HSP70阳性细胞，呈高度表达。大鼠脑缺血/再灌注后，缺血侧皮质、皮质下和海马组织中HSPA8、HSPA1A及HSPA12B3个基因的表达量均略微升高，两处升高的模式相似。单独预适应或后适应均能够显著升高HSPA8、HSPA1A及HSPA12B基因的表达量，其中HSPA1A的表达量则在预适应时升高明显，而HSPA8 mRNA在后适应时表达最高，HSPA12B的表达量两者无明显差异;将预适应联合后适应，上述3个基因的表达量均较单独采用预适应或后适应时显著增高。Western Blot检测p-Akt和p-ERK1/2结果显示:与对照组比较，脑缺血/再灌注后p-Akt和p-ERK1/2表达水平升高;预适应能轻度升高脑缺血/再灌注后p-Akt和明显抑制p-ERK1/2的表达，而后适应明显升高脑缺血/再灌注后p-Akt和轻度抑制p-ERK1/2表达;预适应和后适应联合应用后，升高p-Akt和抑制p-ERK1/2表达的作用明显强于各自单独应用。
　　结论:
　　1、预适应、后适应对大鼠脑缺血/再灌注损伤有保护作用，两者联合应用能进一步增强上述作用;
　　2、预适应、后适应均能上调HSP70的表达，但两者影响的HSP70亚型不同;
　　3、预适应和后适应均能升高p-Akt水平和抑制p-ERK1/2水平;HSPA1A过表达可保护神经胶质细胞氧化损伤，这种保护作用依赖于PI3K/Akt信号通路。

目录

声明

摘要

缩略词

前言

第一章 预适应联合后适应对脑缺血／再灌注损伤的保护作用研究

1．材料

1．1 主要试剂和药品

1．2 主要仪器

2．方法

2．1 实验动物与分组

2．2 局灶性脑缺血／再灌注模型制备

2．3 预适应与后适应处理方法

2．4 神经功能评分

2．5 脑梗塞灶体积测定

2．6 脑组织匀浆生化指标的测定

2．7 TUNEL法原位检测细胞凋亡

2．8 统计学分析

3．结果

3．1 预适应、后适应及预适应联合后适应对大鼠脑缺血，再灌注损伤后神经功能缺陷评分的影响

3．2 预适应、后适应及预适应联合后适应对大鼠脑缺血，再灌注损伤后脑梗死灶体积的影响

3．3 预适应、后适应及预适应联合后适应对大鼠脑缺血，再灌注损伤后脑组织SOD活性和MDA含量的影响

3．4 预适应、后适应及预适应联合后适应对大鼠脑缺血，再灌注损伤后神经元凋亡的影响

4．讨论

5 结论

第二章 预适应联合后适应诱导不同HSP70亚型表达的研究

前言

1 材料

1．1 试剂盒

1．2 其他试剂

1．3 抗体

1．4 主要仪器

2．方法

2．1 实验动物与分组

2．2 免疫组织化学染色检测HSP70蛋白表达

2．3 荧光定量实时(Real Time)PCR检测HSPA8、HSPA1A及HSPA12B基因表达

2．4 统计学分析

3．结果

3．1 预适应、后适应及预适应联合后适应对大鼠脑缺血／再灌注损伤后脑组织HSP70表达的影响

3．2 预适应、后适应及预适应联合后适应对大脑皮质中HSPA8、HSPA1A及HSPA12B基因表达的影响

3．3 预适应、后适应及预适应联合后适应对皮质下HSPA8、HSPA1A及HSPA12B基因表达的影响

3．4 预适应、后适应及预适应联合后适应对海马中HSPA8、HSPA1A及HSPA12B基因表达的影响

4．讨论

5．结论

第三章 预适应联合后适应对Akt、ERK1／2信号通路的影响及与HSP70的关系研究

1 材料

1．1 试剂盒

1．2 其他试剂

1．3 抗体

1．4 主要仪器

2 方法

2．1 Western blot方法检测P-Akt和P-ERK1／2蛋白表达

2．2 质粒DNA的大量制备

2．3 细胞转染

2．4 H2O2浓度的测定

2．5 LDH释放率检测细胞死亡率

2．6 WST-1分析检测细胞存活率

2．7 统计学分析

3．结果

3．1 预适应、后适应及预适应联合后适应对Akt、ERK1／2活化的影响

3．2 抑制PI3K活性取消HSPA1A对H2O2所致神经胶质瘤细胞损伤的保护作用

4、讨论

5、结论

参考文献

综述一 脑缺血再灌注损伤后血管保护研究

综述二 预适应和后适应对神经系统保护的研究进展

攻读学位期间发表的论文

主持的科研项目

致谢