Ezrin蛋白在骨肉瘤侵袭转移中的作用及黄芩素对其表达的影响

摘要

第一部分 Ezrin蛋白在骨肉瘤组织中的表达及其意义
　　目的:探讨Ezrin蛋白在骨肉瘤组织中的表达及其与骨肉瘤临床病理特征的关系。
　　方法:1.收集126例骨肉瘤组织石蜡标本及27例骨软骨瘤组织石蜡标本，通过免疫组化染色检测标本中Ezrin蛋白表达情况;2.分析骨肉瘤组织中Ezrin蛋白表达与患者性别、年龄以及肿瘤直径、病理分型、Ennecking分期、位置、肺部转移等临床病理特征的关系。
　　结果:1.骨肉瘤组织中Ezrin蛋白阳性率(81.74％)明显高于骨软骨瘤组织(29.63％)，差异有显著性(x2=35.63，P＜0.01);2.伴有肺部转移的骨肉瘤组织中Ezrin蛋白阳性率(97.78％)较无肺部转移者(72.84％)增加，差异有显著性(x2=15.68，P＜0.05)，低分化骨肉瘤组织中Ezrin蛋白阳性率(94.87％)也高于中+高分化者(75.86％)（x2=12.32，P＜0.05），但是在不同性别、年龄、肿瘤直径、Ennecking分期及部位的骨肉瘤组织中Ezrin蛋白阳性率并无显著性差异(均P＞0.05)。
　　结论:Ezrin蛋白在骨肉瘤组织中明显升高，且与肿瘤肺转移及恶性程度相关。
　　第二部分 Ezrin siRNA对MG-63细胞生物学行为的影响
　　目的:应用小干扰RNA(siRNA)技术特异性下调Ezrin蛋白在骨肉瘤MG-63细胞中的表达，探讨Ezrin蛋白在骨肉瘤侵袭、转移中的作用。
　　方法:1.设计3对Ezrin siRNA（Ezrin siRNA1、Ezrin siRNA2、EzrinsiRNA3），转染MG-63细胞，采用荧光实时定量PCR、Western blotting检测细胞Ezrin mRNA和蛋白表达水平，筛选出1对干预效果最好的Ezrin siRNA。2.将干预效果最好的Ezrin siRNA、Scramble siRNA分别转染MG-63细胞，并设立1组未转染的空白对照组，采用MTT法检测细胞增殖;3.通过Transwell迁移、侵袭实验检测细胞的迁移、侵袭能力，细胞黏附实验测定细胞的黏附能力4.利用Western blotting检测基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白、波形蛋白、Src、磷酸化Src(p-Src)、Akt、磷酸化Akt(p-Akt)表达;5.30只裸鼠随机分成3组:空白对照组(n=10)、Scramble siRNA组(n=10)和Ezrin siRNA组(n=10)，分别通过鼠尾静脉注射未转染siRNA、转染Scramble siRNA及EzrinsiRNA的MG-63细胞，第42天处死裸鼠，比较实验前后体重及肺表面结节个数。
　　结果:1.Ezrin siRNA3对Ezrin mRNA和蛋白表达的抑制作用优于Ezrin siRNA1、Ezrin siRNA2(P＜0.01)，因此本研究选择EzrinsiRNA3进行后续研究;2.在24h、48h和72h，Ezrin siRNA组吸光度(OD)值小于空白对照组、Scramble siRNA组(P＜0.05);3.Transwell迁移、侵袭实验显示，Ezrin siRNA组穿膜细胞数明显低于空白对照组、Scramble siRNA组(P＜0.05)，同时，Ezrin siRNA组细胞黏附率较空白对照组、Scramble siRNA组降低(P＜0.05);4.与空白对照组、Scramble siRNA组比较，Ezrin siRNA组MMP-2、MMP-9、N-钙粘蛋白、波形蛋白、p-Src、p-Akt表达水平降低(P＜0.01)，而E-钙粘蛋白表达水平升高(P＜0.01)，但Src、Akt表达水平无变化(P＞0.05);5.Ezrin siRNA组实验后裸鼠平均体重较空白对照组、Scramble siRNA组增加(P＜0.05)，但肺表面结节个数较空白对照组、Scramble siRNA组减少(P＜0.05)。
　　结论:1.运用siRNA下调Ezrin蛋白表达可抑制MG-63细胞增殖、侵袭和转移;2.Ezrin siRNA对MG-63细胞侵袭、转移的抑制作用是通过降低MMP-2、MMP-9、N-钙粘蛋白和波形蛋白表达、增加E-钙粘蛋白表达以及抑制Src、Akt磷酸化实现的。
　　第三部分黄芩素通过抑制Ezrin表达和活性抑制MG-63细胞增殖、侵袭
　　目的:观察黄芩素对MG-63细胞增殖、侵袭及Ezrin表达、活性的影响，探讨黄芩素治疗骨肉瘤的相关机制。
　　方法:1.体外培养MG-63细胞，利用无水乙醇将黄芩素稀释成6个浓度梯度:1、2、4、8、16、32μmol/L，分别处理细胞24h、48h、72h，采用MTT法检测细胞增殖，选择黄芩素干预48h，计算黄芩素作用的50％抑制浓度（50％ inhibitory concentration，IC50）;2.随后以无水乙醇（对照组）及10、15μmol/L黄芩素处理MG-63细胞48h，采用Transwell迁移、侵袭实验检测各组细胞的迁移、侵袭能力;3.通过细胞黏附实验测定细胞的黏附能力;4.行荧光实时定量PCR、Westernblotting检测Ezrin mRNA及Ezrin、磷酸化Ezrin(p-Ezrin)蛋白表达。
　　结果:1.随着黄芩素浓度的增加和处理时间的延长，细胞增殖抑制率逐渐升高，差异均有显著性(P＜0.01)，黄芩素干预48h对MG-63细胞增殖的IC50约为18.35μmol/L;2.Transwell迁移、侵袭实验显示，10、15μmol/L黄芩素组穿膜细胞数均低于对照组(P＜0.05，0.01)，黄芩素15μmol/L组穿膜细胞数又低于10μmol/L组（P＜0.05）;3.10、15μmol/L黄芩素组细胞黏附率较对照组降低(P＜0.05，0.01)，且黄芩素15μmol/L组细胞黏附率低于10μmol/L组(P＜0.05)，4.与对照组比较，10、15μmol/L黄芩素组Ezrin mRNA和Ezrin、p-Ezrin蛋白表达水平明显降低，(P＜0.05，0.01)，黄芩素15μmol/L组上述指标低于10μmol/L组(P＜0.05)。
　　结论:1.黄芩素呈时间和剂量依赖性抑制MG-63细胞增殖;2.黄芩素可下调Ezrin mRNA、蛋白表达及其磷酸化活化水平。

目录

声明

摘要

符号说明

1 前言

2 Ezrin蛋白在骨肉瘤组织中的表达及其意义

2．1 引言

2．2 实验材料

2．2．1 实验标本

2．2．2 主要试剂与仪器

2．3 实验方法

2．3．1 HE染色

2．3．2 免疫组化染色

2．3．3 统计学分析

2．4 实验结果

2．4．1 骨肉瘤和骨软骨瘤组织病理学改变

2．4．2 Ezrin蛋白在骨肉瘤和骨软骨瘤组织中的表达

2．4．3 骨肉瘤组织中Ezrin蛋白表达与其临床病理特征的关系

2．5 讨论

2．6 结论

3 Ezrin siRNA对骨肉瘤细胞生物学行为的影响及其机制

3．1 引言

3．2 实验材料

3．2．1 细胞及动物

3．2．2 主要试剂

3．2．3 主要仪器

3．3 实验方法

3．3．1 MG-63细胞培养

3．3．2 Ezrin-siRNA的设计与细胞转染

3．3．3 荧光实时定量PCR

3．3．4 Western blotting

3．3．5 MTT法检测细胞增殖

3．3．6 Transwell迁移实验检测细胞的迁移能力

3．3．7 Transwell侵袭实验检测细胞的侵袭能力

3．3．8 细胞黏附实验

3．3．9 动物实验

3．3．10 统计学分析

3．4 实验结果

3．4．1 最佳Ezrin siRNA选择

3．4．2 Ezrin siRNA对细胞增殖活性的影响

3．4．3 Ezrin siRNA对细胞迁移能力的影响

3．4．4 Ezrin siRNA对细胞侵袭能力的影响

3．4．5 Ezrin siRNA对细胞黏附能力的影响

3．4．6 Ezrin siRNA对裸鼠体重和肺表面转移结节数的影响

3．4．7 Ezrin siRNA对MMP-2、MMP-9表达的影响

3．4．8 Ezrin siRNA对E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白表达的影响

3．4．9 Ezrin siRNA对波形蛋白表达的影响

3．4．10 Ezrin siRNA对Src、p-Src表达的影响

3．4．11 Ezrin siRNA对Akt、p-Akt表达的影响

3．5 讨论

3．6 结论

3．6．1 运用siRNA下调Ezrin蛋白表达可抑制骨肉瘤细胞增殖、侵袭和转移

3．6．2 Ezrin siRNA对骨肉瘤细胞侵袭、转移的抑制作用是通过降低MMP-2、MMP-9、N-钙粘蛋白和波形蛋白表达、增加E-钙粘蛋白表达以及抑制Src、Akt磷酸化实现的

4 黄芩素通过抑制Ezrin表达和活性抑制MG-63细胞增殖、侵袭

4．1 引言

4．2 实验材料

4．2．1 细胞

4．2．2 主要试剂

4．2．3 主要仪器

4．3 实验方法

4．3．1 MG-63细胞培养

4．3．2 MTT法检测细胞增殖

4．3．3 Transwell迁移实验

4．3．4 Transwell侵袭实验

4．3．5 细胞黏附实验

4．3．6 荧光实时定量PCR

4．3．7 Western blotting

4．3．8 统计学分析

4．4 实验结果

4．4．1 黄芩素对细胞增殖的影响

4．4．2 黄芩素抑制细胞增殖的IC50

4．4．3 黄芩素对细胞迁移能力的影响

4．4．4 黄芩素对细胞侵袭能力的影响

4．4．5 黄芩素对细胞黏附能力的影响

4．4．6 黄芩素对细胞Ezrin mRNA蛋白表达的影响

4．4．7 黄芩素对细胞Ezrin、p-Ezrin蛋白的影响

4．5 讨论

4．6 结论

4．6．1 黄芩素呈时间和剂量依赖性抑制骨肉瘤MG-63细胞的增殖

4．6．2 黄芩素可降低Ezrin mRNA、蛋白的表达及其磷酸化活化水平

5 全文结论

参考文献

综述 Ezrin蛋白在肿瘤侵袭转移中的作用

攻读博士学位期间主要成果

致谢