霉酚酸通过表观遗传修饰机制对系统性红斑狼疮患者CD4+T细胞自身免疫相关基因表达的影响

摘要

目的:
　　系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种以T细胞异常活化和自身抗体产生为特点的累及多器官、多系统的自身免疫性疾病，其发病机制目前尚不明确。霉酚酸酯(mycophenolatemofetil，MMF)是一种新型免疫抑制剂，口服后转化为其活性形式霉酚酸(mycopenolic acid，MPA)。目前MMF被广泛应用于难治性狼疮肾炎的治疗。但MMF治疗SLE的分子机制尚未完全明确。本课题通过研究MPA对SLE患者外周血CD4+T细胞表观遗传学状态的影响，初步探讨MPA治疗系统性红斑狼疮的表观遗传学机制。
　　方法:
　　分离8例SLE患者外周血CD4+T细胞，甲醇（溶媒）及MPA(1uM)分别处理病人外周血CD4+T细胞，48小时后收集细胞;总体甲基化定量试剂盒检测外周血CD4+T细胞中基因组DNA甲基化水平;总体组蛋白甲基化及乙酰化定量试剂盒检测外周血CD4+T细胞中组蛋白乙酰化及甲基化水平;逆转录-实时定量聚合酶反应(Reversetranscription-quantitative PCR，RT-qPCR)检测组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferases，HATs)和去乙酰化酶(histone deacetylases，HDACs)的mRNA表达水平;流式细胞学及RT-qPCR检测外周血CD4+T细胞CD40L、CD11a和CD70蛋白和mRNA表达水平;焦磷酸测序（PYRO-sequence）检测CD40L启动子区域DNA甲基化水平;染色质免疫共沉淀法检测CD40L启动子区组蛋白表观遗传修饰状态;酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA）测细胞培养上清中IgG水平。
　　结果
　　与溶媒对照组相比，MPA处理组SLE CD4+T细胞整体DNA甲基化水平无明显改变(P=0.2701);整体组蛋白H3/H4乙酰化水平明显升高(P=0.0335，P=0.0241)，而总体组蛋白H3K4/H3K9甲基化水平无明显改变(P=0.5407，P=0.3868)。RT-qPCR结果显示:与溶媒对照组相比，MPA处理组SLE CD4+T细胞HDAC2、HDAC7和SIRT1的mRNA水平较溶媒对照组明显降低(P=0.0199，P=0.0425，P=0.0225)，CREBBP和PCAF mRNA水平明显升高(P=0.0153，P=0.0201);流式细胞术及RT-qPCR检测显示:MPA处理组SLE CD4+T细胞CD40L表达较溶媒对照组明显降低(P=0.0032)，而CD11a及CD70的表达无明显改变(P＞0.05)。CD4+T细胞与同源B细胞共培养，ELISA检测MPA处理上清中自身抗体IgG水平较溶媒对照组显著降低(P=0.0013)。进一步检测MPA对CD40L启动子区DNA甲基化水平及组蛋白修饰状态的影响，结果显示:与溶媒组相比，MPA处理组SLE CD4+T细胞CD40L基因启动子区DNA甲基化水平无明显改变(P＞0.05)，而CD40L启动子区组蛋白H4乙酰化水平及组蛋白H3K4三甲基化水平显著降低(P＜0.05，P＜0.05)。
　　结论
　　MPA可以上调组蛋白乙酰化酶表达、抑制去乙酰化酶表达，使SLE患者CD4+T细胞整体组蛋白乙酰化修饰水平升高。MPA通过降低CD40L启动子区组蛋白H4乙酰化水平及组蛋白H3K4三甲基化水平抑制SLE患者CD4+T细胞CD40L基因表达，抑制CD4+T细胞的自身反应性。

目录

声明

论文说明

摘要

符号说明

1 前言

2 材料与方法

2．1 研究对象

2．2 仪器设备与试剂

2．2．1 主要仪器设备

2．2．2 主要试剂和耗材

2．2．3 其他常用试剂

2．2．4 常用试剂配制

2．3 实验步骤

2．3．1 分离外周静脉血单个核细胞

2．3．2 磁珠法分选CD4+T细胞

2．3．3 细胞培养及MPA处理

2．3．3 DNA抽提

2．3．4 测定CD4+T细胞基因组整体甲基化水平

2．3．5 组蛋白抽提和组蛋白H3K4／H3K9整体甲基化及组蛋白H3／H4整体乙酰化检测

2．3．6 流式细胞学检测CD4+T细胞CD11a、CD70及CD40L的表达

2．3．7 RNA抽提

2．3．8 逆转录合成cDNA

2．3．9 实时定量RT-qPCR

2．3．10 亚硫酸氢钠处理和焦磷酸测序

2．3．11 ChIP检测CD4+T细胞中CD40L启动子区组蛋白修饰

2．3．12 T、B细胞共孵育和IgG抗体检测

2．3．13 统计学方法

2．4 实验总流程图

3 结果

3．1 MPA对SLE患者CD4+T细胞整体DNA甲基化水平和组蛋白整体乙酰化及甲基化水平影响

3．2 MPA对SLE患者CD4+T细胞中乙酰转移酶(HATs)和去乙酰化酶(HDACs)mRNA表达水平的影响

3．3 MPA对SLE患者CD4+T细胞CD40L、CD11a和CD70蛋白表达水平的影响

3．4 MPA对SLE患者CD4+T细胞CD40L、CD11a和CD70的mRNA表达水平的影响

3．5 MPA对SLE患者CD4+T细胞CD40L基因启动子区DNA甲基化水平的影响

3．6 MPA对SLE患者CD4+T细胞中CD40L基因启动子调控序列组蛋白修饰水平的影响

3．7 MPA对SLE患者CD4+T细胞自身反应性的影响

4 讨论

5 结论

参考文献

综述 DNA低甲基化与系统性红斑狼疮发病机制关系的研究进展

攻读学位期间主要的成果

致谢