淫羊藿素对系统性红斑狼疮Foxp3/Il17a调控作用与分子机制及其治疗MRL/lpr狼疮鼠的实验研究

摘要

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种多器官、多系统受累的自身免疫性疾病。其确切病因及发病机理尚不十分清楚，研究表明，CD4+T细胞在SLE自身免疫反应的启动、维持以及器官损害方面发挥重要作用。调节性T(Treg)细胞和Th17细胞作为特殊的T细胞亚群，其平衡对维持免疫内环境稳定意义重大。大量实验证明，Treg细胞和Th17细胞失衡与自身免疫性疾病特别是SLE的发生发展密切相关[1]。
　　SLE的治疗目前尚无有效根治办法。尽管恰当的应用抗疟药、糖皮质激素、免疫抑制剂，以及生物制剂可使大多数患者达到病情缓解，但是部分患者对这些药物不敏感、部分患者容易复发，部分患者对这些药物的副作用难以耐受。因此，积极探寻新的治疗方法、治疗药物刻不容缓。
　　淫羊藿为传统中草药，来源于小檗科淫羊藿属植物。淫羊藿素(icaritin，ICT)是淫羊藿的主要成分淫羊藿苷的体内代谢产物。在传统医学中淫羊藿是一种补肾壮阳的中药，而现代药理研究表明，淫羊藿有效成分及其提取物具有广泛的生理活性[2]。Zhang等在研究ICT抑制K562细胞株细胞增殖的过程中发现ICT具有下调雌激素受体活性[3]。Li等发现ICT能够抑制T细胞活化从而延长老鼠接受皮肤同种异体移植后的寿命[4]。雌激素受体以及T细胞异常活化在SLE的发病过程中起了重要作用[5]。但是ICT对SLE的治疗作用，国内外尚无相关报道。在此背景下，我们进行了体外用ICT作用于SLE CD4+T细胞以及体内治疗MRL/lpr狼疮鼠的探索。通过体外实验发现ICT能够调控SLE CD4+T细胞Foxp3/IL17a平衡，增强Treg细胞抑制功能与抑制CD4+T细胞过度活化;进一步通过表达谱芯片与siRNA干扰实验证实，ICT引起的转录因子STAT5b表达水平升高继而影响Foxp3/IL17a启动子区组蛋白修饰的改变可能是ICT调控Foxp3/IL17a平衡的机制之一;体内给MRL/lpr狼疮鼠喂养ICT，结果发现ICT能够降低MRL/lpr狼疮鼠尿蛋白水平，减少肾脏组织IgG、C3沉积及改善肾脏组织病理损伤。
　　第一部分 ICT对SLE CD4+T细胞Foxp3/IL17a的调控作用
　　第一节 ICT调控SLE CD4+T细胞Foxp3与IL17a表达
　　目的:
　　探讨ICT对SLE CD4+T细胞Foxp3与IL17a表达水平的影响。
　　方法:
　　免疫磁珠法分离SLE患者外周血CD4+T细胞，用40uM/L ICT刺激CD4+T细胞72h后，采用Real-time RT-PCR法检测Foxp3与IL17a mRNA的表达水平，western blot检测Foxp3蛋白水平，酶联免疫吸附法(ELISA)检测IL17a蛋白水平。
　　结果:
　　1.与对照组相比，ICT组Foxp3 mRNA水平显著升高（对照组vsICT处理组:1±0.0 vs2.288±0.3962，P=0.0019）， IL17amRNA水平显著下降(对照组vs ICT处理组:1±0.0 vs0.4077±0.1839，P=0.002)。2.与对照组相比，ICT组Foxp3蛋白水平显著升高（对照组 vs ICT处理组:0.6167±0.07638 vs1.46±0.2254，p=0.0036），IL17a蛋白水平下降(对照组 vs ICT处理组:41.86±12.82 vs30.34±0.7566，P=0.0344)。
　　结论:
　　ICT能够增强SLE患者外周血CD4+T细胞Foxp3表达，降低IL17a分泌。
　　关键词:淫羊藿素;Foxp3;IL17a;基因表达
　　第二节 ICT对SLE Treg细胞功能与CD4+T细胞自身免疫反应的影响
　　目的:
　　探讨ICT对SLE Treg细胞抑制功能与CD4+T细胞自身免疫反应的影响。
　　方法:
　　免疫磁珠法分离SLE患者外周血CD4+CD25+CD127-Treg细胞，CD4+CD25-T细胞，CD4+T细胞，CD19+B细胞。使用40uM/L ICT刺激CD4+CD25+CD127-Treg细胞72h后，Treg细胞与CD4+CD25-T细胞1∶1共培养5天，采用淋巴细胞增殖试验检测Treg抑制功能，ELISA法检测上清中细胞因子IL10，TGF-β水平。用40uM/L ICT刺激CD4+T细胞72h后，CD4+T细胞与自身CD19+B细胞1∶4共培养8天，收集细胞与上清，ELISA法检测上清中IFN-γ，IL-6，TNF-α水平以及自身B细胞IgG抗体产量，流式细胞术检测CD4+T细胞表面自身免疫分子CD40L，CD70表达水平。
　　结果:
　　1.与对照组相比，ICT组Treg细胞抑制功能增强（对照组vs ICT处理组:33.67±10.97 vs63.1±2.265，p=0.0104），差异具有统计学意义。对照组和ICT组Treg细胞体外扩增2周后，细胞数量无明显差异。
　　2.与对照组相比，ICT组IL-10分泌增加（78.19±35.01 vs196.2±38.21，p=0.0039），差异具有统计学意义。TGF-β分泌物无显著差异（110.2±3.942 vs114.4±5.568，p=0.1626）。
　　3.与对照组相比，ICT组刺激自身B细胞IgG抗体产量显著下降（对照组vs ICT处理组:43.14±12.52 vs6.476±3.364，p=0.0013），差异具有统计学意义。
　　4.与对照组相比，ICT处理组CD4+T细胞分泌IFN-γ，IL-6，TNF-α水平降低（对照组vs ICT处理组:330.6±17.23 vs194.56±6.762，P=0.0252;521.6±61.2 vs251.1±58.9, P=0.0337;750.2±32.753 vs420.6±23.341，p=0.0045），差异具有统计学意义。
　　5.与对照组相比， ICT组CD4+T细胞表面CD40L，CD70表达降低（对照组vs ICT处理组:2±0.1 vs1±0.2，P=0.029;对照组vsICT处理组:3.6±0.26 vs1.46±0.25，P=0.00378）差异具有统计学意义。
　　结论:
　　ICT能够增强Treg抑制功能，抑制CD4+T细胞过度活化及炎性因子的产生。
　　关键词:淫羊藿素;调节性T细胞;CD4+T细胞;细胞因子
　　第二部分 ICT调控SLE CD4+T细胞Foxp3与IL17a表达的分子机制
　　第一节 ICT对Foxp3与IL17a启动子区组蛋白修饰的影响
　　目的:
　　探讨淫羊藿对Foxp3与IL17a启动子区组蛋白修饰的影响。
　　方法:
　　采用第一部分第一节预留的标本，染色质免疫沉淀(ChIP)方法结合实时定量PCR(real-time PCR)法检测Foxp3与IL17a启动子区域H3K4、H3K9三甲基化、H4乙酰化水平。
　　结果:
　　与对照组相比，ICT组SLE患者CD4+T细胞Foxp3启动子区H3K4me3的水平显著升高(对照组vs ICT处理组:1±0.0 vs11.1±3.21，P=0.0081);与对照组相比，ICT组SLE患者CD4+T细胞IL17a启动子区H3K9me3的水平显著升高（对照组vs ICT处理组:1±0.0vs4.367±1.106，p=0.0341）。对照组和ICT组Foxp3/IL17a启动子区H4乙酰化水平无明显差异。
　　结论:
　　ICT通过增强H3K4me3的水平促进Foxp3表达，通过增强H3K9me3的水平降低IL17a表达。
　　关键词:淫羊藿素;H3K4me3;H3K9me3;组蛋白修饰
　　第二节 ICT刺激后SLE CD4+T细胞全基因组表达谱分析
　　目的:
　　通过表达谱芯片了解ICT刺激SLE CD4+T细胞后基因组表达水平的影响，并寻找ICT调控SLE CD4+T细胞Foxp3与IL17a表达的潜在靶点。
　　方法:
　　免疫磁珠法分离2例SLE患者外周血CD4+T细胞，使用40uM/LICT刺激CD4+T细胞72h后，收集细胞、抽提总RNA，Affymetrix表达谱芯片检测全基因组基因表达差异。采用GO分析以及Pathway分析找到富集差异的GO分类条目与Pathway条目;采用Real-timeRT-PCR法验证挑选出的差异基因。
　　结果:
　　与对照组相比，ICT组共检出3倍以上差异基因1007个，其中上调612个（占差异基因60％），下调395个（占差异基因40％）。GO分析以及Pathway分析发现ICT主要影响免疫反应相关生物过程与信号通路的改变。挑选出的4个差异基因(IRF-4，STAT5a，STAT5b，HIF-1)是能够共同调控Foxp3/IL17a表达的转录因子，Real-time RT-PCR验证结果显示这4个基因的表达趋势与基因芯片检测结果一致，其中STAT5b显著升高，差异具有统计学意义(1±0 vs2.467±0.1508, p=0.0339)。
　　结论:
　　ICT主要下调SLE CD4+T细胞免疫相关生物过程与信号通路的基因表达，其中STAT5b可能是ICT调控Foxp3/IL17a的潜在靶点。
　　第三节 ICT刺激后STAT5b的改变及其与Foxp3/IL17a的关系
　　目的:
　　探讨干扰STAT5b后，淫羊藿对Foxp3/IL17a表达的调控是否改变。
　　方法:
　　设计针对STAT5的小干扰RNA，电穿孔法瞬时转染活动性SLE患者的CD4+T细胞，再予ICT刺激24h。收集细胞后，用Real-timeRT-PCR及Western Blot检测STAT5b干扰效果，用Real-time RT-PCR检测Foxp3与IL17a mRNA水平。
　　结果:
　　干扰STAT5b后，ICT组较对照组Foxp3改变无统计学差异（1±0 vs1.073±0.07959，p=0.17），IL17a升高，但无统计学差异(1±0vs1.293±0.01839, p=0.18)。
　　结论:
　　干扰STAT5b后，ICT不能调控Foxp3/IL17a表达。
　　关键词:淫羊藿素;STAT5b;电穿孔;转染
　　第三部分 ICT对MRL/Ipr狼疮鼠的治疗作用
　　目的:
　　探索ICT对MRL/lpr狼疮鼠的治疗作用。
　　方法:
　　SPF级别14周龄雌性MRL/lpr狼疮鼠20只，随机分成2组，其中实验组10只，对照组10只。实验组每天喂养ICT（用羧甲基纤维素制成糊状），对照组每天喂养等量溶剂羧甲基纤维素(CMC)。ELISA法检测抗dsDNA抗体，IL-10，TGF-β，IFN-γ水平，尿蛋白试纸检测尿蛋白水平，直接免疫荧光法检测肾脏组织IgG，C3沉积，HE染色检测小鼠肾脏损害情况。
　　结果:
　　1.对照组与ICT喂养组MRL/lpr狼疮鼠抗dsDNA抗体、IL-10，TGF-β，IFN-γ水平比较
　　喂养4周后，即小鼠20周龄时，ELISA结果显示，与对照组相比， ICT喂养组抗dsDNA抗体分泌降低(67140±4836 vs55080±9596，p=0.0371)，差异具有统计学意义;IL-10分泌降低（6441±479.9vs5627±486.6，p=0.0116），差异具有统计学意义;TGF-β分泌无明显改变（110.2±3.942 vs114.4±5.568，p=0.1626）;IFN-γ分泌无明显改变（493.9±25.94 vs497±41.58，p=0.8675）。
　　2.对照组与ICT喂养组MRL/lpr狼疮鼠尿蛋白比较
　　经过4周ICT治疗后，与对照组相比，ICT喂养组尿蛋白显著降低（300±73.02967 vs84.2857±38.72105，P=0.0198），差异具有统计学意义。
　　3.对照组与ICT喂养组MRL/lpr狼疮鼠肾脏组织免疫荧光IgG，C3沉积
　　IgG，C3直接免疫荧光结果显示:ICT喂养组狼疮鼠肾小球系膜区着色亮度不清晰，荧光强度较弱，IgG，C3沉积较少;而对照组狼疮鼠肾小球系膜区肾脏着色明显，亮度耀眼，IgG，C3沉积较多。
　　4.对照组与ICT喂养组MRL/lpr狼疮鼠肾脏病理评分
　　HE染色结果显示，与对照组相比，ICT喂养组肾脏病理肾小球评分降低（8.36±1.067 vs6.72±0.7935，p=0.0129），差异具有统计学意义;肾脏病理肾小管评分降低(8.16±1.328 vs6.04±1.054，p=0.012)，差异具有统计学意义。
　　结论:
　　ICT对MRL/lpr狼疮鼠肾脏损害有一定的治疗作用

目录

声明

论文说明

摘要

缩略词表

前言

第一部分 ICT对SLE CD4+T细胞Foxp3／IL17a的调控作用

第一节 ICT调控SLE CD4+T细胞Foxp3与IL17a表达

前言

材料和方法

结果

第二节 ICT对SLE Treg细胞功能与CD4+T细胞自身免疫反应的影响

前言

材料和方法

结果

讨论

第二部分 淫羊藿调控SLE CD4+T细胞Foxp3与IL17a表达的分子机制

第一节 淫羊藿对Foxp3与IL17a启动子区组蛋白修饰的影响

前言

材料和方法

结果

第二节 淫羊藿刺激后SLE CD4+T细胞全基因组表达谱分析

前言

材料和方法

结果

第三节 淫羊藿刺激后STAT5b的改变及其与Foxp3／IL17a的关系

前言

材料和方法

结果

讨论

第三部分 淫羊藿对MRL／lpr狼疮鼠的治疗作用

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述 药物性狼疮

攻读学位期间主要的研究成果

致谢