从T辅助细胞的分化探讨胆碱能抗炎通路对类风温关节炎的保护作用机制

摘要

第一部分迷走神经及乙酰胆碱受体激动剂-烟碱对胶原诱导性关节炎小鼠T辅助细胞分布的影响
　　目的:T辅助细胞(helper T cell，Th cell)在调控类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)炎症反应中起了非常关键的作用。胆碱能抗炎通路可抑制RA动物模型-胶原诱导性关节炎(collagen inducedarthritis，CIA)小鼠的关节炎症。本部分探讨迷走神经及乙酰胆碱受体激动剂-烟碱对CIA小鼠体内T辅助细胞亚群分布的影响。
　　方法:40只DBA/1小鼠随机分成4组:对照组:假手术+每天腹腔注射PBS一次;模型组:假手术+每天腹腔注射PBS一次+CIA模型复制;迷走神经切断术组:迷走神经切断术+每天腹腔注射PBS一次+CIA模型复制;烟碱处理组:假手术+每天腹腔注射烟碱一次+CIA模型复制。迷走神经切断术组在关节炎复制前4天切断小鼠左颈部迷走神经，假手术仅暴露并不切除左侧颈部迷走神经。烟碱组在关节炎复制的前4天每天腹腔注射烟碱(250μg/kg)。评估小鼠关节炎症指数及关节组织病理炎症程度。酶联免疫吸附方法检测小鼠外周血IFN-γ、IL-4和IL-17A水平。流式细胞术检测小鼠脾脏中Th1、Th2及Th17细胞比例。Western-blot技术检测小鼠脾脏中Th1、Th2及Th17细胞对应的专一性转录因子T-bet、GATA3及RORγτ的表达水平。免疫组化法检测小鼠关节滑膜中RORγτ的表达情况。
　　结果:乙酰胆碱受体激动剂烟碱显著减轻CIA小鼠关节炎症。迷走神经切断组小鼠关节炎症较CIA组加重，但两组间差异无统计学意义。与CIA组比较，烟碱组外周血IL-17A水平降低，IL-4水平增高;烟碱组脾脏中CD4+IL-17A+T细胞比例降低，CD4+IL-4+T细胞比例升高;烟碱组脾脏中Th17细胞专一性转录因子RORγτ表达下调，Th2细胞专一性转录因子GATA3表达上调;烟碱组关节滑膜中RORγτ表达降低;烟碱组和CIA组外周血IFN-γ、脾脏CD4+IFN-γ+T细胞比例及T-bet表达差异无统计学意义。
　　结论:烟碱减轻CIA小鼠关节炎症;烟碱减少CIA小鼠外周血、脾脏及关节滑膜Th17细胞分布;增加外周血及脾脏中Th2细胞分布，但对外周血及脾脏中Th1细胞分布无影响。
　　第二部分乙酰胆碱受体激动剂对RA患者Th17细胞分化的影响及MEK-ERK1/2通路在其中的作用
　　目的:Th17细胞亚群的分布异常及其细胞效应与RA炎症发生发展密切相关，本部分探讨乙酰胆碱受体激动剂烟碱和GTS-21对RA患者Th17细胞分化的影响。
　　方法:分离RA患者外周血单个核细胞(peripheral bloodmononuclear cells，PBMCs)，加入不同浓度烟碱及GTS-21培养，ELISA法检测培养上清中IL-17A水平;用磁珠分选法从RA患者外周血PBMCs中分离得到CD4+T细胞，在Th17极化培养体系中加入烟碱或GTS-21，或α7烟碱型乙酰胆碱(nicotinic acetylcholine，nAch)受体阻断剂α银环蛇毒预刺激后再加入烟碱或GTS-21处理，ELISA检测培养上清中IL-17A水平，流式细胞术检测Th17细胞比例，Western-blot法检测RORc表达;CD4+T细胞经Th17分化培养72小时后，予烟碱，或MEK1/2抑制剂U0126预刺激后再加烟碱处理，ELISA检测培养上清中IL-17A水平，Western-blot法检测ERK1/2表达。
　　结果:不同浓度烟碱及GTS-21均可降低RA PBMCs培养上清中IL-17A水平。烟碱及GTS-21可减少Th17细胞分化过程中CD3+CD8-IL-17A+T细胞比例，减少培养上清中IL-17A水平及胞内RORc的表达，而α银环蛇毒可逆转烟碱及GTS-21对Th17细胞分化的抑制作用。烟碱可促进Th17细胞内ERK1/2的磷酸化，而U0126可阻断烟碱对ERK1/2的磷酸化。
　　结论:烟碱及GTS-21通过作用于α7nAch受体抑制RA患者CD4+T细胞向Th17细胞分化，烟碱对Th17细胞分化的抑制作用与激活MEK1/2-ERK1/2信号通路有关。
　　第三部分乙酰胆碱受体激动剂对RA患者Th1、Th2细胞分化的影响
　　目的:在RA中，Th2细胞比例减少，Th1细胞比例增多，Th1/Th2比例失衡促进了RA关节炎症的发生发展。本部分探讨乙酰胆碱受体激动剂烟碱和GTS-21对RA患者Th1和Th2细胞分化的影响。
　　方法:分离RA患者外周血PBMCs，加入不同浓度烟碱及GTS-21培养，ELISA检测培养上清中IFN-γ和IL-4水平;用磁珠分选法从RA患者外周血PBMCs中分离得到CD4+T细胞，分别在Th1、Th2分化培养体系中加入烟碱或GTS-21，或乙酰胆碱受体阻断剂α银环蛇毒预刺激后再加入烟碱或GTS-21处理，ELISA检测培养上清中IFN-γ和IL-4水平，流式细胞术检测Th1和Th2细胞比例，Western-blot法检测T-bet和GATA3表达。
　　结果:GTS-21可降低RA PBMCs培养上清中IFN-γ水平。GTS-21可减少Th1细胞分化过程中CD3+CD8-IFN-γ+T细胞比例，减少培养上清中IFN-γ水平及胞内T-bet的表达，银环蛇毒可逆转GTS-21对Th1细胞分化的抑制作用。但烟碱对CD3+CD8-IFN-γ+T细胞比例、培养上清中IFN-γ水平及胞内T-bet表达无影响。烟碱和GTS-21可提高PBMCs培养上清中IL-4水平，烟碱及GTS-21可增加Th2细胞分化过程中CD3+CD8-IL-4+T细胞比例、增加培养上清中IL-4水平及胞内GATA3的表达，而银环蛇毒可逆转GTS-21对Th2细胞分化的促进作用。
　　结论:GTS-21通过作用于α7nAch受体抑制RA患者CD4+T细胞向Th1细胞分化，烟碱对Th1细胞分化无影响;烟碱和GTS-21通过作用于α7nAch受体促进RA患者CD4+T细胞向Th2细胞分化。

目录

声明

论文说明

摘要

符号说明

前言

技术路线图

第一章 迷走神经及乙酰胆碱受体激动剂-烟碱对CIA小鼠Th细胞分布的影响

1．材料与方法

1．1 材料

1．2 实验方法

1．3 统计学分析

2．结果

2．1 迷走神经及烟碱对CIA小鼠关节炎症的影响

2．2 迷走神经及烟碱对CIA小鼠血清中IFN-γ、IL-4及IL-17A水平的影响

2．3 迷走神经及烟碱对CIA小鼠脾脏中Th1、Th2及Th17细胞比例的影响

2．4 迷走神经及烟碱对C1A小鼠脾脏中T-bet、GATA3及RORγτ表达的影响

2．5 迷走神经及烟碱对CIA小鼠关节滑膜RORγτ表达的影响

3．讨论

4．结论

第二章 乙酰胆碱受体激动剂对RA患者Th17细胞分化的影响及MEK1／2-ERK1／2通路在其中的作用

1．材料与方法

1．1 材料

1．2 实验方法

1．3 统计学分析

2．结果

2．1 乙酰胆碱受体激动剂对RA PBMCs IL-17A表达的影响

2．2 乙酰胆碱受体激动剂及拮抗剂对RA PBMCs和Th17细胞增殖的影响

2．3 乙酰胆碱受体激动剂对RA Th17细胞分化过程中CD3+CD8-IL-17A+T细胞百分比的影响

2．4 乙酰胆碱受体激动剂对RA Th17细胞分化过程中培养上清中IL-17A水平的影响

2．5 乙酰胆碱受体激动剂对RA Th17细胞分化过程中RORc表达的影响

2．6 烟碱对Th17细胞ERK1／2磷酸化的影响

2．7 MEK1／2抑制剂U0126对烟碱作用的Th17细胞ERK1／2磷酸化的影响

3．讨论

4．结论

第三章 乙酰胆碱受体激动剂对RA患者Th1、Th2细胞分化的影响

1．材料与方法

1．1 材料

1．2 实验方法

1．3 统计学分析

2．结果

2．1 乙酰胆碱受体激动剂对RA Th1细胞分化的影响

2．2 乙酰胆碱受体激动剂对RA Th2细朐分化的影响

3．讨论

4．结论

第四章 总结论

参考文献

综述 神经反射对免疫系统的调节及其与类风湿关节炎的关系

攻读学位期间主要成果

致谢