HDAC2和HDAC4参与TSA对神经病理性疼痛镇痛作用机制的研究

摘要

目的:本课题拟采用坐骨神经结扎(CCI)法构建神经病理性疼痛模型，鞘内注射组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂曲古菌素A(TSA)，通过观察大鼠疼痛行为学的改变，验证TSA对神经病理性疼痛大鼠的镇痛作用。并选择性观察HDAC亚型HDAC2和HDAC4蛋白酶在CCI大鼠腰段脊髓的动态变化，探讨可能参与神经病理性疼痛表观遗传调控的HDAC亚型。然后通过观察TSA对HDAC2和HDAC4及疼痛相关分子GAD65表达的影响，初步探讨HDAC亚型参与神经病理性疼痛潜在的表观遗传调控通路，为神经病理性疼痛的治疗研究提供一条新思路。
　　方法:
　　1.健康成年雄性SD大鼠，体重220～250g，随机分为4组:Sham+DMSO组、CCI+DMSO组、CCI+TSA10μg组和CCI+TSA2μg组。CCI组建立左侧CCI模型，sham组仅暴露左侧坐骨神经而不结扎，各组大鼠术后第7天疼痛行为学测定后分别鞘内注射溶剂5％DMSO、TSA10μg和2μg(溶于5％DMSO)。术前1天及术后3、7、10、14、21天分别测定足底机械痛阈和热痛阈，观察鞘内注射TSA对疼痛行为学的改变。
　　2.取健康成年雄性SD大鼠，体重220～250g，随机分为Sham组和CCI组，Sham组仅暴露左侧坐骨神经而不结扎，CCI组建立左侧CCI模型。分别于术前1天及术后3、7、14、21天测定足底机械痛阈和热痛阈，并取大鼠术后3、7、14、21天腰段脊髓（约L4-L6节段）。采用免疫荧光、Western-blot技术测定HDAC2和HDAC4蛋白的动态变化。
　　3.取1中sham+DMSO组(sham组)、CCI+DMSO组(CCI组)和CCI+TSA10μg组（TSA组）三组大鼠术后第10天的腰段脊髓组织。Western-blot法检测大鼠腰段脊髓HDAC2、HDAC4蛋白和GAD65蛋白的表达水平，QPCR法检测大鼠腰段脊髓HDAC2和HDAC4mRNA的水平。
　　结果:
　　1.CCI术后大鼠左后肢机械痛阈和热痛阈值于第7天开始明显降低，第14天达到最低值，与基础值及sham组大鼠痛阈均有明显差异(P＜0.05);鞘内注射TSA大剂量（10μg组）可同时缓解CCI大鼠的机械痛敏和热痛敏，且镇痛作用在术后10天时（给药完成1天后）最明显，可持续至14天;而小剂量（2μg组）只在术后10天时减轻了大鼠的机械痛，未缓解大鼠的热痛敏。
　　2.HDAC2和HDAC4阳性细胞广泛分布于大鼠腰段脊髓组织，脊髓灰质的阳性表达远远高于白质，且脊髓背角表达致密。HDAC2蛋白主要位于神经元细胞核内，在星形胶质细胞和小胶质细胞中几乎不表达;而HDAC4主要位于神经元胞质。CCI大鼠腰段脊髓HDAC2和HDAC4蛋白水平较sham组明显增高(P＜0.05)，且蛋白水平随疼痛行为的发展而动态变化。
　　3.CCI组与sham组相比，HDAC2和HDAC4蛋白表达量及mRNA相对表达量明显增高(P＜0.05)。TSA组与CCI组相比，HDAC2和HDAC4蛋白量降低(P＜0.05)，HDAC2和HDAC4 mRNA相对表达量差异无统计学意义(P＞0.05)。CCI组大鼠腰段脊髓GAD65蛋白表达量较sham组明显降低(P＜0.05)，而TSA组GAD65蛋白量较CCI组增高(P＜0.05)。
　　结论:
　　1.鞘内注射曲古菌素A(TSA)可缓解坐骨神经慢性缩窄性损伤(CCI)导致的神经病理性疼痛大鼠的机械痛敏和热痛敏。
　　2.CCI所致的神经病理性疼痛大鼠腰段脊髓中，HDAC2和HDAC4均有大量表达，且主要表达于神经元细胞内，其中HDAC2主要位于胞核而HDAC4主要位于胞质;HDAC2和HDAC4蛋白表达水平随疼痛行为的发展而发生动态变化。
　　3.鞘内注射TSA可逆转CCI大鼠腰段脊髓HDAC2和HDAC4蛋白水平的增高。GAD65蛋白在CCI所致的神经病理性疼痛大鼠腰段脊髓中表达下降，而鞘内注射TSA可增高GAD65的蛋白水平。

目录

声明

摘要

缩略词简表

前言

第一章 鞘内注射TSA对神经病理性疼痛大鼠的镇痛作用

技术路线图一

1．1 材料

1．2 方祛

1．3 结果

1．4 讨论

1．5 结论

第二章 CCI大鼠腰段脊髓HDAC2和HDAC4蛋白的表达变化

技术路线图二

2．1 材料

2．2 方法

2．3 结果

2．4 讨论

2．5 结论

第三章 HDAC2和HDAC4可能通过调控GAD65的表达参与TSA对神经病理性疼痛的镇痛机制

技术路线图三

3．1 材料

3．2 方法

3．3 结果

3．4 讨论

3．5 结论

全文结论

参考文献

综述 组蛋白去乙酰化酶在神经系统中的研究进展

攻读博士学位期间主要研究成果

致谢