PP2Ac介导Smad3中间区去磷酸化促肾间质纤维化研究

摘要

目的：
　　通过TGF-β1体外刺激人肾小管上皮细胞(HK-2)建立肾间质纤维化细胞模型，拟(1)通过PP2Ac过表达及小干扰RNA质粒转染HK-2细胞研究PP2Ac在肾小管间质纤维化中作用;(2)探讨PP2Ac促肾小管间质纤维化是否与其介导Smad3中间连接区去磷酸化有关。
　　方法：
　　1、常规培养HK-2细胞，实验分组:空白对照组、TGF-β1刺激组（模型组）、质粒转染+TGF-β1组（PP2Ac过表达和小干扰RNA质粒转染HK-2细胞后，予5ng/ml TGF-β1刺激干预24h）。采用RT-PCR和Western blot法检测PP2Ac、FN、Col-Ⅰ、α-SMA和E-cadherin mRNA及蛋白表达水平。
　　2、常规培养HK-2细胞同上，实验分组:空白对照组、TGF-β1刺激组（模型组）、质粒转染+TGF-β1组(PP2Ac过表达和小干扰质粒转染HK-2细胞后，TGF-β1刺激1h)。分别提取总蛋白和核蛋白，采用Western blot法检测Smad3、Smad3中间连接区pSmad3-L(Ser204)、pSmad3-L(Ser208)蛋白表达情况。
　　结果：
　　1.RT-PCR和Western blot结果均显示:TGF-β1刺激HK-2细胞24h使得PP2Ac表达上调的同时，FN、Col-Ⅰ和α-SMA表达增加，E-cadherin表达下降，纤维化加重;PP2Ac过表达质粒转染HK-2细胞再予TGF-β1刺激24h后，PP2Ac mRNA及蛋白水平表达均较TGF-β1刺激组升高，同时FN、Col-Ⅰ和a-SMA表达明显上调，E-cadherin表达下调，纤维化进一步加重;PP2Ac小干扰RNA转染HK-2细胞再予TGF-β1刺激24h后，较TGF-β1刺激组，PP2Ac的mRNA及蛋白表达均降低， FN、Col-Ⅰ和a-SMA表达减少，E-cadherin表达增高，纤维化缓解。差异均有统计学意义(P＜0.05)。
　　2.予TGF-β1刺激HK-2细胞后以Western blot检测不同时间点PP2Ac、pSmad3-L(Ser204)、pSmad3-L(Ser208)和Smad3的变化。实验结果显示在TGF-β1刺激HK-2细胞1h时可使PP2Ac的表达上调达到高峰，同时pSmad3-L(Ser204)在TGF-β1刺激1h左右表达最高，pSmad3-L(Ser208)在1/2h处达高峰，但1h处仍表达明显，Smad3在各时间点的表达基本无变化。故在下面的实验中选用TGF-β1刺激HK-2细胞1h研究PP2Ac促肾间质纤维化是否与其介导Smad3中间连接区去磷酸化有关。
　　3.Western blot结果显示:TGF-β1刺激HK-2细胞1h使得PP2Ac蛋白表达上调的同时，总蛋白和核蛋白中pSmad3-L(Ser204)和pSmad3-L(Ser208)表达均增加;HK-2细胞转染PP2Ac过表达质粒再予TGF-β1刺激1h后，较TGF-β1刺激组PP2Ac表达进一步增高，总蛋白和核蛋白中pSmad3-L(Ser204)、pSmad3-L(Ser208)表达均下降;PP2Ac小干扰RNA转染HK-2细胞再予TGF-β1刺激1h后，PP2Ac较TGF-β1刺激组表达减少，同时总蛋白和核蛋白中pSmad3-L(Ser204)、pSmad3-L(Ser208)蛋白表达均增加。差异均有统计学意义(P＜0.05)。
　　结论：
　　1.PP2Ac的表达同FN、Col-Ⅰ和a-SMA表达正相关，与E-cadherin表达负相关，提示PP2Ac促进细胞外基质的生成及肾小管EMT;
　　2.PP2Ac通过介导Smad3中间连接区去磷酸化，即抑制其磷酸化促进肾间质纤维化。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 PP2Ac对人肾小管上皮细胞细胞外基质合成及EMT的作用

1．1 材料与方法

1．1．1 实验材料

1．1．2 实验方法

1．1．3 统计学分析

1．2 结果

1．2．1 转染PP2Ac过表达质粒对TGF-β1刺激的HK-2细胞的影响

1．2．2 转染PP2Ac小干扰RNA对TGF-β1刺激的HK-2细胞的影响

1．3 讨论

1．4 小结

第二章 PP2Ac介导肾小管上皮细胞Smad3中间连接区去磷酸化作用研究

2．1 材料与方法

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验方法

2．1．3 统计学分析

2．2 结果

2．2．1 TGF-β1诱导HK-2细胞PP2Ac表达的最佳时间点

2．2．2 TGF-β1诱导HK-2细胞Smad3蛋白磷酸化的最佳时间点

2．2．3 PP2Ac过表达质粒转染后对TGF-β1刺激的HK-2细胞的影响

2．2．4 PP2Ac小干扰RNA转染后对TGF-β1刺激的HK-2细胞的影响

2．3 讨论

2．4 小结

结论

参考文献

综述 PP2A在肿瘤中的调节作用及其展望

攻读学位期间主要研究成果

致谢