HIV Vpr通过上调miR-122表达促进丙型肝炎病毒RNA复制及其蛋白合成

摘要

背景和目的:
　　HIV和HCV因有着共同的传播途径，其混合感染在临床上很常见。大量的研究证实在HIV/HCV混合感染患者中肝硬化和肝癌的发生率较HCV单独感染患者明显增高，且混合感染患者生存率降低，流行病学资料亦证实HIV/HCV混合感染者血清中HCVRNA载量较HCV单独感染者明显升高，提示HIV促进HCV复制，可能为HIV/HCV混合感染患者中HIV导致HCV肝脏疾病加重的主要原因。但到目前为止HIV/HCV混合感染中HIV影响HCV复制的具体机制仍未明确，且此方面的研究甚少，临床治疗措施有限，因此，开展HIV影响HCV复制分子发病机制的研究，一直是国内外HIV/HCV混合感染研究领域的亮点，且具有重要的临床与科学价值。HIV蛋白被发现在HIV影响HCV复制的过程中扮演着重要角色，而Vpr蛋白作为HIV重要的辅助蛋白之一，通过其介导HIV整合前复合物(preintegration complex，PIC)的核运输，进而促进HIV-1感染未分化细胞;通过诱导细胞周期停滞在G2分裂期，调控HIV-1长末端重复序列(LTR)及宿主基因的转录激活，并调节NF-κB的活性，因而在HIV的持续感染和致病过程中有着重要作用。在本研究中，我们探讨了Vpr对HCV复制的影响及其调控机制，旨在为HIV影响HCV复制的机制提供新的实验依据。
　　方法:
　　通过构建HCV5'UTR驱动的荧光素酶报告基因和miR-122启动子驱动的荧光素酶报告基因，通过使用两种HCV感染细胞模型，HCVJFH1感染细胞模型和OR6细胞模型，采用荧光定量PCR技术、免疫蛋白印迹和荧光素酶活性实验检测Vpr对HCVRNA复制和HCV蛋白表达的影响。通过双荧光素酶活性实验检测Vpr对HCV5'UTR活性的调控影响。此外，通过双荧光素酶活性实验和Realtime PCR检测Vpr对miR-122启动子活性、precusormiR-122和miR-122 mRNA转录影响。进一步通过使用miR-122抑制剂抑制miR-122的表达，予以荧光素酶活性实验、荧光定量PCR技术和免疫蛋白印迹检测miR-122在Vpr上调HCV5'UTR活性，促进HCVRNA复制和HCV蛋白表达中的影响。
　　结果:
　　通过构建HCV5'UTR驱动的荧光素酶报告基因，我们发现Vpr可上调HCV5'UTR的活性，呈剂量依赖性。另外，通过使用Molt-4细胞和Huh7.5.1细胞共培养，结果发现Vpr可从淋巴细胞中分泌出来，独立进入肝细胞中发挥生物学效应。Vpr在JFH1感染细胞系统中显著促进HCVRNA的复制和HCV蛋白的表达;在OR6细胞中，Vpr同样可明显上调HCV海肾荧光素酶活性，并增强HCV蛋白的表达。Vpr稳定表达细胞株予以HCVJFH1感染后也证实Vpr可在JFH1感染后72小时和30d均明显促进HCVRNA的复制及增强HCV蛋白的表达。进一步的研究表明Vpr可通过上调miR-122的启动子活性，precusor miR-122和miR-122 mRNA转录进而在转录水平上调miR-122的表达。另外，使用针对miR-122的抑制剂，能显著阻断Vpr对HCV5'UTR的上调作用，同样还可在JFH1感染系统和OR6细胞中miR-122抑制剂显著废除Vpr对HCVRNA复制和HCV蛋白的影响。
　　结论:
　　我们的研究结果证实Vpr通过上调miR-122的转录水平，并上调HCV5'UTR的活性，从而促进HCVRNA的复制和增强HCV蛋白的表达。同时首次发现Vpr可从淋巴细胞中分泌出来，独立地进入肝细胞中发挥生物学效应。这些研究结果说明miR-122在Vpr促进HCV复制中起关键作用，为HIV影响HCV复制的机制提供了新的研究方向。

目录

声明

摘要

英文缩略语表

第1章 绪论

1．1 HIV／HCV混合感染概述

1．2 HIV辅助蛋白Vpr的研究进展

1．3 MiR-122的研究进展

第2章 实验材料与实验方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

第3章 Vpr对HCV复制的调控及其生物学影响

3．1 研究背景

3．2 Vpr对HCV 5’UTR的影响

3．3 Vpr对HCV复制的影响

3．4 讨论

3．5 结论

第4章 Vpr通过上调miR-122转录促进HCVRNA复制和HCV蛋白表达

4．1 研究背景

4．2 Vpr对miR-122的影响

4．3 miR-122在Vpr上调HCV 5’UTR活性作用中的影响

4．4 miR-122在Vpr促进HCV复制作用中的影响

4．5 讨论

4．6 小结

第5章 全文小结和展望

参考文献

附录

攻读学位期间主要的研究成果

致谢