LIPIN1在昼夜节律中的调节作用研究

摘要

昼夜节律是机体调节自身生理活动和行为来适应环境的近24小时的周期性变化。昼夜节律的调节方式是由正调控元件和负调控元件组成的转录/翻译负反馈环路。除此之外，昼夜节律还受到其他许多因素调控，其中最重要的一个因素就是能量代谢，但是能量代谢影响昼夜节律的分子机制尚不清楚。我们通过酵母双杂交技术筛选发现LIPIN1与BMAL1分子之间存在相互作用。LIPIN1蛋白参与脂质合成和能量代谢。本研究拟进一步研究LIPIN1在昼夜节律和能量代谢中的作用，探讨能量代谢影响昼夜节律的可能通路。
　　目的:阐明LIPIN1在昼夜节律中的作用;研究LIPIN1是否介导了能量代谢对昼夜节律的调节。
　　方法:通过免疫沉淀验证LIPIN1和BMAL1的相互作用;通过GSTpull down的方法寻找LIPIN1与BMAL1，CLOCK相互作用的结合域;通过荧光素酶报告系统研究LIPIN1对BMAL1，CLOCK的功能的影响;通过构建LIPIN1的突变体，检测萤光素酶活性，寻找LIPIN1对BMAL1，CLOCK的功能影响的结构域;通过免疫荧光共定位寻找LIPIN1在细胞中发挥影响BMAL1，CLOCK功能的可能性原因的解释。通过LIPIN1基因敲除小鼠的行为学实验，研究LIPIN1对昼夜节律的作用;通过实时定量荧光PCR研究LIPIN1敲除后对时钟基因表达的影响。
　　结果:LIPIN1与BMAL1、CLOCK之间存在相互作用， LIPIN1b的C端是其与BMAL1、CLOCK相互作用的重要结构域。在小鼠肝脏中，LIPIN1与BMAL1的相互作用具有昼夜节律性，在CT8-CT16最高。LIPIN1可以剂量依赖性地抑制CLOCK/BMAL1的转录活性。其可能的作用机制是促进BMAL1从细胞核转移到细胞质中。LIPIN1基因敲除小鼠肝脏中一些CLOCK/BMAL1靶基因表达的昼夜节律出现变化，主要表现为CT9的表达量比野生型小鼠高。白天进食可以逐步逆转小鼠肝脏的节律基因表达，而这种改变在LIPIN1基因敲除小鼠中变缓。LIPIN1在果蝇神经系统的表达呈现昼夜节律。干扰果蝇神经系统的LIPIN1导致昼夜节律行为和时钟基因表达出现异常。
　　结论:我们的研究表明，LIPIN1可以偶联能量代谢和昼夜节律，使机体的能量代谢和昼夜节律协调一致。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

前言

第一章 LIPIN1抑制CLOCK／BMAL1的转录活性

1．1 实验材料与试剂

1．1．1 实验仪器

1．1．2 主要实验试剂

1．1．3 主要试剂配制

1．1．4 实验用细胞和质粒

1．2 实验方法

1．2．1 LIPIN1与BMAL1、CLOCK免疫共沉淀

1．2．2 GST pull down探究LIPIN1与BMAL1、CLOCK结合结构域

1．2．3 萤光素酶报告系统检测LIPIN1对CLOCK／BMAL1转录活性的影响

1．2．4 筛选LIPIN1影响CLOCK／BMAL1转录活性的功能结构域

1．2．5 LIPIN1调节BMAL1的亚细胞定位

1．3 实验结果

1．3．1 LIPIN1与BMAL1、CLOCK之间相互作用

1．3．2 GST pull down探究LIPIN1的结合结构域

1．3．3 萤光素酶报告系统检测LIPIN1对CLOCK，BMAL1的抑制作用

1．3．4 筛选LIPIN1抑制效应的功能结构域

1．3．5 LIPIN1调节BMAL1的亚细胞定位

1．4 分析与讨论

第二章 LIPIN1敲除小鼠的节律行为和时钟基因表达

2．1 实验材料与试剂

2．1．1 实验仪器

2．1．2 主要实验试剂

2．1．3 主要试剂配制

2．1．4 实验用小鼠

2．2 实验方法

2．2．1 免疫共沉淀检测小鼠肝脏中LIPIN1与BMAL1，CLOCK相互作用

2．2．2 LIPIN1敲除小鼠行为学实验检测昼夜节律变化

2．2．3 LIPIN1敲除小鼠时钟基因表达

2．2．4 改变进食后LIPIN1小鼠昼夜节律时钟基因的表达

2．3 实验结果

2．3．1 小鼠肝脏中LIPIN1与BMAL1，CLOCK相互作用

2．3．2 LIPIN1敲除小鼠行为学实验检测昼夜节律变化

2．3．3 LIPIN1敲除小鼠影响昼夜节律时钟基因表达

2．3．4 进食影响LIPIN1敲除小鼠昼夜节律时钟基因的表达

2．4 分析与讨论

第三章 LIPIN1在果蝇中调节昼夜节律

3．1 实验材料与试剂

3．1．1 实验仪器

3．1．2 主要实验试剂与耗材

3．1．3 主要试剂的配制

3．1．4 实验用果蝇

3．2 实验方法

3．2．1 神经系统中LIPIN1 RNAi果蝇的行为学实验

3．2．2 神经系统中LIPIN1 RNAi果蝇的时钟基因表达

3．3 实验结果

3．3．1 神经系统中LIPIN1 RNAi果蝇的昼夜节律减弱

3．3．2 神经系统LIPIN1 RNAi果蝇昼夜节律时钟基因表达下降

3．4 分析与讨论

全文总结

参考文献

综述 昼夜节律和新陈代谢的关系研究进展

在读期间主要研究成果

致谢