人胚胎干细胞早期培养过程DLK1-DIO3印记区和X染色体失活状态不稳定性研究

摘要

第一章早期培养对人类胚胎干细胞(hESCs)遗传稳定和基因表达的影响
　　目的:既往的研究发现在长期培养的hESCs(＞P30)中会发生一些遗传和表观遗传的改变，然而，对于P30以前是否也发生了一些改变目前知之甚少，我们的研究目的在于利用我们胚胎干细胞库的丰富资源，评估hESCs在分离后的早期培养过程（20代以前）的遗传学改变和基因表达的改变。
　　材料和方法:利用我们胚胎干细胞库的胚胎干细胞资源，分别选取核型正常的分离初始期（P4-P9）和早期(P20-P30) hESCs，其中5株进行SNP芯片用于分析遗传变化，12株行全基因组表达谱芯片用于分析基因表达变化。
　　结果:从我们选取的细胞库中核型正常，并已完成各项检查的12株hESCs的初始期和早期未分化样本进行的以上实验可得到以下结果(1)SNP芯片分析结果可知，有一些小片段的缺失和重复，这些片段的平均大小约为100 kb，且不存在规律性的改变。(2)从表达谱的分析来看，在两个阶段的样本间平均仅有0.10±0.09％的基因（检测的38500基因中有12-136个发生改变）发生显著性改变(＞2-fold，t-test，P＜0.05)。(3)两个阶段样本间共同的的变化是早期女性样本中XIST基因的沉默和早期大部分样本中DLK1-DIO3印记区域中相关转录子的沉默，以MEG3，SNORD114-3为代表。
　　结论:在胚胎干细胞培养的早期阶段，遗传物质未发生显著的规律性改变，而从转录水平来看，基因表达整体变化较小，但存在共同的差异:XIST基因和DLK1-DIO3印记区域在早期hESCs中的沉默。
　　关键词:人胚胎干细胞;早期培养;遗传;XIST基因;DLK1-DIO3印记区
　　第二章生理氧培养能阻止hESCs早期培养阶段普遍发生的DLK1-DIO3印记区的异常沉默
　　目的:DLK1-DIO3印记区是一个进化上保守的印记区域，位于人类14号染色体(14q32)，在小鼠中的研究发现，在小鼠iPS细胞重编程过程易发生Dlk1-Dio3印记区的异常沉默，其沉默损害了iPS在四倍体囊胚补偿实验中形成完全iPS来源的成体小鼠的能力。基于第一章中DLK1-DIO3印记区在早期hESCs中易发生沉默的现象，回答以下问题:1， DLK1-DIO3印记区编码的其他小RNA是否受MEG3沉默的影响，2，确定第一章中DLK1-DIO3印记区的沉默是一种普遍现象还是个例，3，该印记区沉默的调控机制，4，初始期的hESCs是否是一种正常的印记状态，5，沉默是什么原因引起的以及对hESCs分化能力是否有影响？
　　材料和方法:1，在配对的初始期和早期hESCs中，采用small RNA深度测序方法对DLK1-DIO3印记区编码的其他小RNA(包括miRNAs和snoRNAs)的表达情况进行了分析。2，利用Real-time PCR方法检测了细胞库中更多细胞系中DLK1-DIO3印记区的表达状态，同时利用GEO数据库，利用生物信息学评估了国际上常用的hESCs及一些hiPSC系中该印记区的表达状态。3，DLK1-DIO3印记区受DLK1和MEG3间的基因间差异甲基化区域和MEG3启动子区域的差异甲基化区域所调控，采用亚硫酸盐测序的方法对这些调控区域的甲基化状态进行了评估。4，利用MEG3外显子区域的SNP位点，通过对表达产物进行sanger测序，对MEG3的表达模式（单等位或双等位）进行了分析。5，针对第一章中确定发生沉默的细胞系，采用体内外分化实验（EB和畸胎瘤实验）对沉默前后的hESCs进行了分化能力的分析，并分析了分化能否逆转MEG3的沉默。6，针对DLK1-DIO3在部分细胞系中不发生沉默着手，提出了氧浓度可能是影响该印记区活化状态的关键因素的推断，通过在生理氧分离、培养新的细胞系检测MEG3活性和相关调控区域的甲基化状态对该推断进行了验证。7，将大气氧条件分离的hESCs在初始期阶段转入生理氧条件长期培养，Real-timePCR检测分析其能否阻止MEG3的发生沉默。
　　结果:1，在hESCs早期培养过程，DLK1-DIO3印记区的沉默还包括该区域编码的miRNAs和snoRNAs的沉默。2，从我们实验室和国际上其他实验室更多多能性细胞系的分析结果可知，DLK1-DIO3印记区的沉默是多能性干细胞（包括hESCs和iPS）在常规培养条件下极其常见的表观遗传改变。3，MEG3的沉默伴随着MEG3启动子区域和MEG3、DLK1基因间调控区域的高度甲基化。4，hESCs培养初始期是单等位表达模式，为正常的印记状态。5，从hESCs分化能力来看，该印记区沉默后，仍具有体内外多向分化潜能，但分化后，沉默的MEG3不会被激活;6，大气氧的分离和培养是引起该印记区沉默的关键因素，生理氧分离和培养能维持该印记区的活化状态。7，大气氧浓度分离的初始期hESCs转入生理氧浓度培养不能逆转MEG3的沉默。
　　结论:在我们的研究中揭示了一个hESCs在早期培养过程经常发生的表观异常现象-DLK1-DIO3印记区的异常沉默，这种沉默不光发生在我们细胞库中的细胞，国际上其他其他实验室的一些多能性细胞系包括hES和hiPS也经常发生这种沉默，其沉默伴随着调控区域的高度甲基化，DLK1-DIO3沉默在培养过程不可逆且会传递给分化的子代细胞。进一步，我们的研究发现20％的氧是引起这种改变的主要原因，把胚胎干细胞维持在5％浓度下分离、培养可以阻止这种改变的发生。我们的研究强调从最初始期开始培养条件对hESCs表观稳定性就有重要作用。
　　关键词:DLK1-DIO3印记区;异常沉默;5％生理氧;20％大气氧
　　第三章追溯人胚胎干细胞分离和早期培养过程X染色体失活(XCI)动态变化
　　目的:X染色体失活(XCI)是女性细胞为了维持X连锁基因剂量补偿所必需的，有一些研究报道了长期培养的女性胚胎干细胞系中存在多种XCI状态。同时，对于早期胚胎中的XCI状态仍存在争议。XIST是XCI启动和维持的关键基因，我们的目的一方面在于评估在培养早期阶段XCI的变化和其对hESCs的影响以及分离过程X染色体失活状态，另一方面我们探讨了氧浓度对XCI状态的影响。
　　材料和方法:1，采用XISY基因Real-time PCR检测结合H3K27me3免疫细胞化学判断X染色体失活标记在hESCs和其子代细胞中的表达情况;2，从X染色体转录活性和迟复制状态判断整条X染色体的活性;3，通过芯片结果比较两个阶段X染色体连锁基因的表达，评判X连锁基因表达变化;4，通过直接测序的方法:X连锁基因的表达情况为单等位表达还是双等位表达来评估X染色体失活模式;5，通过在生理氧条件下重新分离、培养hESCs，评估氧浓度为XCI状态的影响;6，通过XCI标记H3K27me3点状聚集和多能性标记OCT4免疫细胞化学共染评判hESCs分离过程X染色体失活的状态。
　　结果:1，在培养的初始期阶段，女性hESCs表达失活标记XIST和H3K27me3的点状聚集，在早期培养过程，XIST逐渐下调，H3K27me3点状聚集也逐步消失，至P20代以后，标记几乎完全丢失，这些标记的表达方式会传递给分化的子代细胞。2，从整条X染色体的转录活性来看，初始期和早期hESCs都拥有一条X染色体无转录活性，处于迟复制状态。3，从X染色体连锁基因的转录水平来看，在这个标记丢失的过程，约4％的X连锁基因出现了1.5-2倍上调。4，从失活模式来看，初始期hESCs拥有一条随机失活的X染色体，而随着培养的进行，早期hESCs中的失活模式转变成了完全的偏斜失活模式。5，大部分生理氧条件分离、培养的女性hESCs在早期培养阶段能维持正常的XCI状态。6，在hESCs分离过程，在囊胚阶段，女性样本有一条失活的X染色体，而在分离过程，首先会出现X染色体的重新活化（约为受精后第8天），随后又很快启动一条X染色体的失活（受精后第10天）。
　　结论:在目前的分离、培养体系，女性hESCs在早期培养过程中会出现X染色体失活的动态变化，即从拥有一条随机失活的X染色体到一条偏斜失活且部分基因活化的X染色体，可知目前常规应用的大气氧培养条件有待进一步改进，而生理氧培养有利于女性hESCs维持正常的XCI状态，;人类早期胚胎拥有一条失活的X染色体，在分离过程，会瞬时的出现两条活化的阶段，随后启动XCI，类似小鼠早期发育过程中的XCI变化。

目录

声明

论文说明

摘要

专业名称缩写中英文对照表

第一章 早期培养对人胚胎干细胞遗传稳定和基因表达的影响

1 背景

2 材料和方法

2．1 试剂和仪器设备

2．2 SNP芯片标本的制备

2．3 Affimetrix SNP 6．0芯片实验流程

2．4 SNP芯片数据分析

2．5 表达谱芯片样本的制备

2．6 全基因组表达谱芯片实验流程

2．7 表达谱芯片样本数据分析

3 结果

3．1 SNP芯片的结果

3．2 表达谱芯片结果

4 讨论

5 结论

第二章 生理氧培养能阻止hESCs早期培养阶段普遍发生的DLK1-DIO3印记区的异常沉默

1 背景

2 材料和方法

2．1 材料和试剂

2．2 Solexa小RNA高通量测序

2．3 实时定量RT-PCR方法

2．4 印记调控区域甲基化分析方法

2．5 GEO芯片数据分析方法

2．6 体内外分化实验

2．7 免疫细胞化学

2．8 生理氧胚胎干细胞系的分离、培养和鉴定

2．9 单等位表达分析

2．10 数据分析统计方法

3 结果

3．1 solexa小RNA深度测序结果显示MEG3的沉默伴随着该印记区miRNAs和snoRNAs的沉默

3．2 DLK1-DIO3的沉默伴随着相关调控区域的高度甲基化

3．3 胚胎干细胞在培养初始期是一种正常的印记状态

3．4 DLK1-DIO3印记区的沉默在人多能性细胞中是普遍发生的现象

3．5 在分化过程中MEG3的沉默是不可逆的

3．6 生理氧分离和培养能维持DLK1-DIO3印记区处于正常活化状态

3．7 20％氧浓度分离的hESCs转5％氧浓度培养不能阻止MEG3的沉默

4 讨论

5 结论

第三章 追溯人胚胎干细胞分离和早期培养过程X染色体失活动态变化

1 背景

2 材料和方法

2．1 材料和试剂

2．2 荧光定量real-time PCR分析XIST表达

2．3 XIST启动子甲基化分析

2．4 囊胚收集

2．5 单等位表达分析

2．6 RNA POL Ⅱ免疫荧光与X染色体荧光原位杂交的共染

2．7 免疫细胞化学

2．8 荧光原位杂交FISH

2．9 芯片分析方法

2．10 迟复制实验

3 结果

3．1 早期培养过程女性hESCs中XCI状态变化

3．2 XIST基因的沉默伴随着其调控区域的高度甲基化

3．3 hESCs的XCI状态会传递给分化的子代细胞

3．4 培养初始期和早期的hESCs都有一条失活的X染色体

3．5 XIST阴性的ehESCs中出现了部分X连锁基因的重新活化

3．6 早期培养过程XCI模式从随机失活转变为完全偏斜失活

3．7 生理氧培养有利于女性hESCs维持正常的XCI状态

3．8 hESCs建系过程XCI状态动态变化

4 讨论

5 结论

下一步的研究计划

参考文献

综述 人胚胎干细胞体外长期培养过程中的遗传和表观遗传的不稳定性研究进展

附录

攻读学位期间主要成果

致谢