PAMAM/PEI聚合物大分子介导的抗体固定研究

摘要

在免疫分析中，其灵敏性、再生性和稳定性都直接决定于抗体或抗原在基体表面的固定，而传统的固定方法有着抗体或抗原结合数量少、易变性造成失活以及导向不正确不能识别目标物等问题。因此，几乎所有的研究一直都致力于得到抗体或抗原数量较多、活性保持及导向正确的固定方法。本文比较了六种不同的抗体固定方法用于酶联免疫分析（ Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）检测抗原的优劣：直接将抗体进行物理吸附；将聚苯乙烯（Polystyrene, PS）表面羧基化以后以酰胺键连接上聚乙烯亚胺（Polyethylene polyimide, PEI）,再用戊二醛将抗体嫁接在PEI上；将PS表面羧基化以后以酰胺键连接上聚酰胺-胺树状大分子（Polyamidoamine dendrimers, PAMAM）,再用戊二醛将抗体嫁接在PAMAM上；先将葡萄球菌蛋白 A（Staphylococcus protein A, SPA）物理吸附于PS表面，再利用SPA与抗体之间的相互作用将抗体固定；将PEI嫁接到羧基化的PS表面后用戊二醛将SPA与PEI连接，最后利用SPA与抗体之间的相互作用将抗体固定；将PAMAM嫁接到羧基化的PS表面后用戊二醛将SPA与PAMAM连接，最后利用SPA与抗体之间的相互作用将抗体固定。结果表明，其吸光值最高达到了常规方法的10倍，并且梯度非常明显，是一种很有前途的检测方法。
　　本文用X-射线光电子能谱仪（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）比较了PEI及PAMAM处理前后聚苯乙烯表面各元素的含量变化，结果显示未处理的PS表面C含量特别高，且不含氮，而PEI和PAMAM处理后，PS表面的C含量下降，N的含量则分别新增到7.35％和9.69%，表明氨基的加入。用原子力显微镜（Atomic force microscope, AFM）表征各种方法固定抗体前后聚苯乙烯表面的形貌可以看出，未处理的PS表面粒状突出物几乎没有，而接了抗体的PS表面则都有很多凸起，同时，与其他表面相比，物理吸附抗体的PS表面粒状突出物最少，说明此方法固定的抗体数量较少，其他方法固定抗体后的PS表面粒状突出物相对来说多一些，说明能固定较多的抗体。用辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase, HRP）标记的羊抗鼠-Fab和羊抗鼠-Fc进行ELISA结果确定了当抗体是与SPA结合时则基本能正确导向，而没有SPA时，固定的抗体暴露出的Fab部分和Fc部分几乎是等同的，说明有大量的活性位点无法接触到。

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第一章 绪论

1.1 抗体在基体表面固定的方法

1.1.1物理吸附

1.1.2共价键固定

1.1.3位点导向固定

1.2基体表面抗体的免疫分析方法

1.2.1 酶联免疫吸附分析

1.2.2聚丙烯酰胺凝胶电泳

1.3 用于抗体固定的中间分子及基体材料介绍

1.3.1聚酰胺-胺树状大分子简介

1.3.2聚乙烯亚胺简介

1.3.3 用于抗体固定的基体材料介绍

1.4 本文的研究内容与意义

第2章 PAMAM树状大分子的合成与表征

2.1仪器、材料与试剂

2.2 实验操作

2.2.1 聚酰胺-胺树状大分子的合成

2.2.2 聚酰胺-胺树状大分子的表征

2.3 结果分析与讨论

2.3.1实验结果分析

2.3.2实验操作讨论

第3章 PAMAM/PEI介导的抗体固定

3.1仪器、材料与试剂

3.1.1 主要仪器设备

3.1.2 实验材料

3.1.3 主要药品和试剂

3.1.4 配制的溶液及浓度

3.2 实验操作

3.2.1 羧基化聚苯乙烯微孔

3.2.2 羧基化聚苯乙烯微孔的氨基化

3.2.3 抗体固定

3.2.4 物理吸附及通过吸附SPA进行的抗体固定

3.2.5 AFP酶联免疫吸附

3.3 检测方法

3.3.1 X-射线光电子能谱仪

3.3.2 原子力显微镜

3.3.3 SDS-PAGE凝胶电泳

3.3.4荧光显微镜

3.3.5夹心式酶联免疫吸附分析

3.3.6用抗-Fab和抗-Fc进行的酶联免疫吸附分析

3.4 结果分析与讨论

3.4.1 X-射线光电子能谱仪结果分析

3.4.2 原子力显微镜结果分析

3.4.3 SDS-PAGE凝胶电泳结果分析

3.4.4 荧光显微镜结果分析

3.4.5 AFP酶联免疫分析

3.4.6 用抗-Fab和抗-Fc进行的酶联免疫吸附分析

3.5总结

第4章 结论与展望

4.1 结论

4.2 主要创新点

4.3 展望

参考文献

致谢

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